この作品は、ナノシステム研究センター（CNS）、無のNSF賞の下で国立科学財団によってサポートされている国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク（NNIN）のメンバーで、一部で実施された。 ECS-0335765。 CNSは、ハーバード大学の一部である。

整列機能心筋組織を生成するためのプロトコルは、大きく3つの部分に分けることができます。ソフトリソグラフィ技術を用いてマイクロパターンマスタの製造は、次のプロトコルの一部とは見なされませんが、確立された方法6に基づいて行うことができる。 1。 PDMS基板上にフィブロネクチンのマイクロコンタクトプリンティング<ol><li>ミックスシルガード10時01分硬化剤の比率をベースと脱ガス気泡を除去するためにデシケーターを使用して、アセンブリで184（ダウコーニング）のPDMSエラストマー。 </li><li> 20μm幅と室温または65℃で4時間で2日間のどちらかに20μmの間隔で区切られた2μmの背尾根、°Cが微小構造のPDMSスタンプを取得すると以前に製造されたマスターに対してPDMSを硬化させる。 </li></ol> *デシケーター中で硬化は非常に任意の気泡を除去することをお勧めします。 <ol start="3"><li>ガラスカバースリップ（ 例えば上にスピンコートPDMS15μmの厚さであっても薄いとPDMS基板を製造するために車間スピンコーターを用いて2分間5,000 rpmで22x22のmm）です。 </li><li>埃や汚れの粒子を除去するために、70％エタノールでスタンプをきれいにしてください。空気が乾燥してみましょう。 </li></ol> *スタンプが複数回使用することができますが、定期的にPDMSスタンプを更新する時間をかけて表面の摩耗により推奨されます。 <ol start="5"><li> 275ミリトルで1分間、SPIプラズマPrep IIプラズマクリーナーとプロセスに置きスタンプはPDMSの表面が親水性にする。 </li></ol> *酸素プラズマ処理は監視すべきである。長い治療時間は、エラストマーの割れが発生することがあります。 <ol start="6"><li> 1分間、70％エタノールでスタンプを滅菌する。圧縮空気で素早く乾燥。 </li></ol> *さらなるステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットで行うべきです。 <ol start="7"><li> Fでスタンプ表面を覆うibronectin液（蒸留H 2 O中の50μg/ ml）を。それが吸着する少なくとも10分してみましょう。 </li><li>スタンプからフィブロネクチンソリューションを振り払うと圧縮空気で素早く乾燥。 </li><li> 2分間スタンプおよびPDMS基板間の等角接触を確立し、しっかりと押してください。 </li><li>蒸留H 2 Oでマイクロパターン基板をすすぐ最初に使用しない限り、4℃で2週間の最大のddH 2 O中で保管してください。蒸留H 2 OのストアPDMSスタンプ</li></ol> 2。ダブルトランスジェニック胚性幹細胞株の維持まず、培養マウスES細胞については、次のメディアを準備します。 マウス胚線維芽細胞（MEF）ミディアム：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、ES細胞や分化グレード、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（P / S） 胚性幹細胞（ESC）ミディアム：DMEM、15％FBSをES細胞グレード、非必須アミノ酸（NEAA）1％、0.5％、P / S、0.2％白血病阻害因子（LIF）、0.0007％2 - メルカプトエタノール（2-ME）を<ol><li>蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン滅菌0.1％コート6ウェルプレート</li><li>円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにMEFを加え、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。 MEF-培地に再懸濁したMEF。 </li><li>ウェルに吸着、吸引過剰ゼラチンおよびadd MEFの後。 MEFは1日、添付することができます。 </li></ol> * 3 6ウェルプレート用の千万のMEFで十分のアリコート。 <ol start="4"><li> MEFには添付している場合には、円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにES細胞を追加し、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。再懸濁したESは、ESC-培地中の細胞とMEFを含むウェルに追加します。合流点に到達するまで、ESC-培地で培養したES細胞。 </li></ol> *一度ES細胞は継代はのrequです、合流点に達している繁茂を回避し、ES細胞コロニーを維持するために、赤外発光ダイオード。 <ol start="5"><li>継代のためにES細胞を準備します。吸引ESC-培地と滅菌PBSで1回洗浄します。 </li><li> PBSを吸引除去し、トリプシンの500μlを添加する。 37℃で3.5分プロセス℃まで</li><li> ES細胞コロニーを打破​​し、ESC-培地500μlでそれを中和するために、上下に数回トリプシン溶液をピペット。 </li><li>ご希望の比に応じて通過したES細胞は、通路1月30日に先に調製したMEFを持つ別のウェルに33μlの転送など 。 ESC-培地でES細胞を維持。 </li></ol> * 1/30の通過率は、ES細胞が3日以内にコンフルエントに到達することができます。通過したES細胞は、あなたのin vitro分化のスケジュールに従って。 （3）二重トランスジェニック胚性幹細胞株および心臓前駆細胞の単離とその種のインビトロ分化まず、followiを準備ES細胞のin vitroでの分化に必要なNGメディア： 適応-ミディアム：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、15％FBSをES細胞グレード、1％NEAA、0.5％、P / S、0.2％、LIF、0.0007％2-ME 分化ミディアム：IMDM、15％のFBS分化グレード。 1パーセントNEAA、0.5％、P / S、0.1Mアスコルビン酸の0.35％、0.0007％2-ME <ol><li> ES細胞がコンフルエントに達したときのin vitro分化に起動します。蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン無菌の0.1％のコート10cmの培養皿を</li></ol> * in vitroでの分化過程の期間に注意してください。心臓前駆細胞を単離することができるようになるまで、それは8日かかります。それに応じてあなたの実験を計画します。 <ol start="2"><li>以前のように収穫したES細胞。吸着、吸引過剰ゼラチン後、準備された文化にES細胞懸濁液の約1/3-1/2追加適応-培地を含む料理をお楽しみいただけます。 2日間の培養細胞。 </li></ol> *あなたの実験によると適応のためのES細胞の量を選択してください。 <ol start="3"><li>収穫は1を使用してPBSを含む50mlコニカルチューブにES細胞を適応した。トリプシンの5ミリリットル。 5分間1,000 rpmで解離したES細胞を遠心分離し、分化培地で再懸濁します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて15cmの培養皿で10μlのドロップあたり約1000個の細胞の胚様体（EB）を作る。 37℃で2.5日間滴をぶら下げとしてプレートや文化EBを反転℃に</li><li> 2.5日後、1 37℃でさらに3.5日間分化培地や文化、それらを使用して℃に6月8日15cmの培養皿のプールのEB </li><li> 3.5日後には、円錐形の50mlチューブにEBSを収集し、それらを約5分間、底に沈むことができます。上清を吸うと滅菌PBSでEBを洗う。 EBをAPPRための底に再び沈むましょうoximately 5分。 </li><li> 2でそれらを処理することにより、EBを解離する。 37℃の水浴中で2分間トリプシンを5ml℃〜そっとチューブを振る。次に、2を追加します。 5トリプシン溶液に滅菌PBSミリリットルと10ミリリットル血清ピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。 7.5パーセントのFBS ES細胞または分化グレードおよびPBS中の0.01％DAPIを含むFACS緩衝液10mlでトリプシンを中和する。 </li><li> 5分間1,000 rpmで解離EBを遠心分離し、FACS緩衝液約1mlに再懸濁します。 1mlのピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。 </li></ol> *解離EBの推定量に応じて、FACS緩衝液を追加します。あまりに高度に濃縮された細胞は、FACSの間に詰まらせることがあり、あまりにも低濃度の細胞が不必要にFACSの時間を延長することがあります。 <ol start="9"><li>取得するために35μmのセルストレーナーで滅菌丸底チューブに細胞を移し単一細胞懸濁液。 </li><li> FACSAriaフローサイトメーターを用いて分化したES細胞を選別し、CVPの精製された集団を得る。 </li></ol> *私たちは、高度に精製された着色された細胞を単離するためのマルチステップゲーティング戦略を開発した。簡単に言えば、我々前方散乱振幅（FSC-A）と側方散乱振幅（SSC-A）（ 図1A）上の最初の門。これは、私たちは細胞の破片から全細胞を分離することができます。その後、我々は、FSCと前方散乱光幅（FSC-W）（ 図1B）にゲート。これは、私たちはダブレットおよび他の細胞集合体から細胞シングレットを特定することができます。次に我々のSSC-及び側方散乱幅（SSC-W）（ 図1C）でゲート。これは、細胞シングレットの純度を向上させます。その後、我々は、DAPIでゲート非生存細胞（ 図1D）から生細胞を（DAPI陰性）を単離する染色。それから私達Phycoeryhthrin振幅（PE）とPE-シアニン色素7振幅（PE-Cy7-）上のゲート（R +真赤陽性を得るために </&gt;をSUP）と（R赤陰性真- ）細胞と自家蛍光赤陰性細胞（ 図1E）を除外する。 R +とR -細胞はフルオレセインイソチオシアネートの振幅（FITC）で別々に次にゲートされると、PE-緑真陽性（G +）と（ - G）グリーン陰性真ソートするために、これらの集団内の細胞（ 図1F + 1G）。次のようにセルの4集団でこの結果：R + G +、R + G -であり 、R - G +とR - G - （ 図1H）。 <ol start="11"><li> 10分間蒸留H 2 O中1％プルロニックF-127とマイクロパターン基板を不動態化する。その後、滅菌PBSで彼らは3倍洗う。 </li></ol> *プルロニックF-127は、そのブロックの細胞接着界面活性剤である。これは、マイクロパターン化エリアへの細胞接着の閉じ込めをサポートしています。 <ol start="12"><li>パターン化された領域の周囲のPDMSガスケットを取り付けしっかりと押し込みます。フィブロネクチンマイクロパターン基板上に続いて、シードは、CVP。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

このプロトコルでは、我々は彼らが整列し、心筋細胞のようなロッド形状を取ることができますどのような心原性前駆細胞の精製された集団を区別し、フィブロネクチンマイクロパターン基板上シードそれらをするための方法を提示した。正常な細胞組織は、心筋組織のために、特に、正常な組織機能8,10のために重要です。心筋細胞は、異方性セル·アレイを形成する際に、11,13 ...

薬物療法における最近の進歩にもかかわらず、高度な心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因のままです。臨床症状は、機能心筋組織の損失および罹患した個体の代謝要求を満たすために、心不全のその後不能から生じる。心臓が限られた再生能力を持っているので、自家心臓移植は、直接失わ機能的な心臓組織を補充を目的とした、現在臨床的に認められ治療法です。ドナー心臓および長期免疫抑制療法の必要性の限られた数を含む、心臓移植の重大な欠点は、この治療法の普及の使用を排除する。その結果、薬物療法では、心疾患患者の治療の主力となっている。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroで正常と病的心筋の生理を繰り返す細胞アッセイの識別である。 <html>幹細胞生物学と組織工学技術の最近の収束は、心臓再生のための新しい有望な道を発生させます。再生可能な患者固有のソースから機能的な心筋組織を生成すると、フィールド内の主要な進歩であろう。これは、医薬品開発と発見のための疾患特異的な細胞アッセイの開発が可能になると心臓の再生医療のための基礎を築くだろう。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と、もっと重要なのは、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、心室前駆細胞および成熟した心室筋細胞の潜在的に再生可能な患者固有のソースを表します。幹細胞生物学と組織工学戦略の組み合わせでは、創薬のためか、進行した心不全の治療のための心臓再生のアプローチにおける細胞アッセイの開発に使用することができるin vitroで機能的な心臓組織を生成することで、この問題に対処しています。 _content &quot;&gt;心臓再生における中心的な課題は、最適な細胞タイプの同定されています。様々なソースから異なる多能性心臓前駆体が発見されているものの、細胞の広い配列が、しかし、今日まで、細胞の識別を1に研究されているこのような筋原細胞の運命へのコミットメントなどの重要な要件を満たしているソースは、機能的な心筋組織へのin vivoまたは in vitroおよび組成の展開する能力を維持することは、中心的な問題であることが証明された2。我々は以前に二重トランスジェニックマウス系を記載しているそれは非常にin vitroで分化したES細胞から、コミットされた心室性前駆細胞の集団（CVP）を精製単離を可能にします私たちはMEF2C遺伝子のISL1依存エンハンサーの制御下のDsRed赤色蛍光タンパク質を発現する新規な二重トランスジェニックマウスを作製し、の制御下で増強された緑色蛍光タンパク質心臓特異的エンハンサーNkx2.5。この2色の蛍光レポーターシステム、MEF2CとNkx2.5遺伝子の発現に応じて蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離することができる開発ES細胞からの第一及び第二の心臓フィールド前駆細胞に基づく。 CVPは、心臓組織の再生を目的とした偉大な約束を提供しています何の心筋マーカーとの構造的および機能的な資質3の発現パターンに基づいて、心筋細胞に似ている。 組織工学の分野における多くの進歩があったが、ネイティブの細胞構造を模倣することは重要な課題として残されている。この課題に対処するための従来の方法は 、in vitro での細胞と播種生物学的または合成足場が含まれています。急速な分解、限られた物理的および機械的安定性と低細胞密度1,4,5含む足場、の多くの欠点のために、我々は足場のない組織を設計しようとしました。 Altキーハフ心臓の細胞が細胞外マトリックスタンパク質の分泌によってそれらの局所微小環境を変更することができ、それらは細胞外手がかりがない状態で棒状の心筋細胞に自分自身を整理するための、より限られた能力を持っている。このように、機能的な心筋組織を構成する細胞は、適切な空間および生物学的な手がかりを提供するテンプレートが必要です。マイクロコンタクトプリントは、正確に位置合わせ機能心筋組織の生成のために重要であるすべては細胞の形状、組織、機能6-8を 、制御するための簡単かつ安価な手法を提供することにより、この課題に対応します。それは正確なパターンで、PDMS基板上に細胞外マトリックスタンパク質の沈着を有効にしてこのように空間的に細胞接着に影響を与えることが2μm9に至るまで、機能·サイズの微小構造のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの使用を含む。 ここで、我々は、幹CELで組織生体工学技術を組み合わせることを提案するlは生物学異方性、機能心筋組織を生成する。したがって、我々はここで、次のための私達の最近出版されたアプローチを示す：（1）境界の心筋組織のためのテンプレートを生成するためのマイクロコンタクトプリンティングによるPDMS基板上にマイクロパターンタンパク質表面の生成（2）高から心臓前駆細胞の精製分離ES細胞は 、in vitro で分化、および（3）の両方の技術の組み合わせは、整列機能的な心筋組織を生成する。

<table border="1"><tbody><tr><td> マテリアルの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> L-アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4544 </td><td>蒸留H 2 O中0.1M溶液を準備</td></tr><tr><td>デシケーター、真空10インチ</td><td>ノヴァテック·インターナショナル、Inc。 </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール、塩酸塩（DAPI） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria IIフローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清ES細胞グレード</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 100から106 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清分化グレード</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 100から500 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からフィブロネクチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F4759 </td><td>蒸留H 2 O中で1 mg / mlに可溶化</td></tr><tr><td> Fisherfinestプレミアムカバーガラス22x22mm </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から548-B </td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮膚由来のゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1890 </td><td> ddH 2 Oを0.1％の溶液を調製</td></tr><tr><td>車間スピンコーター</td><td>ヘッドウェイ·リサーチ社</td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td>イスコフ改変ダルベッコ培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>セルフLIFの分泌細胞株から調製された</td><td></td><td> 500分のストック溶液を調製</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td>ギブコ</td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td>マウス胚線維芽細胞</td><td>日12月15日マウス胚から採取した</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2443 </td><td>蒸留H 2 O中の1％の溶液を調製</td></tr><tr><td>丸底チューブ35μmのセルストレーナー付き</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPIプラズマPrep IIプラズマクリーナー</td><td> SPI用品</td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td> 184 SIL ELASTキット0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>ギブコ</td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td>真空計</td><td> SPI用品</td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

高度な心不全は、生存および/または完全に機能する心筋細胞の損失から生じる、主要な臨床上の満たされていない課題である。最適な薬物療法にもかかわらず、心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因を表しています。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroでの正常および病的な人間の心筋の生理学を再現細胞アッセイの識別である。同様に、回生心臓生物学における主要な課題は、臨床的に関連する量で患者固有心筋前駆細胞の同定および単離を中心に展開。これらの細胞は、ネイティブ心臓組織構造に似ている機能的な組織に組み込まれなければならない。マイクロコンタクトプリントは、このように空間的に細胞接着を制御するために幾何学的な手がかりを提供して、心臓の構造組織に似ている正確なマイクロパターンタンパク質形状の作成 ​​が可能になります。ここに我々は非常にin vitroで 、細胞外マトリックスタンパク質とマイクロパターン化細胞成長表面の生成、および異方性の心筋組織への幹細胞由来の心筋細胞の集合体で分化する多能性幹細胞から心筋細胞を精製単離するための我々のアプローチについて説明します。

in vitroで分化したES細胞でのFACS精製は、前駆細胞の4つの異なる集団（ 図1）を明らかにした。マイクロパターンフィブロネクチンの存在は、連続的なフィブロネクチンライン（ 図2）の完全な転送を表示免疫蛍光顕微鏡検査法により確認された。 G +集団-フィブロネクチン微細パターン上に、FACS分離された前駆体のメッキがR + G <...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K ビュー.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. 整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成し?...

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Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

生物工学

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

要約

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心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

スキャフォールドフリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

非遺伝的光刺激によるCa²⁺ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

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心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

スキャフォールドフリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

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