孝行長崎から実験支援;;失明を防ぐための研究本研究は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しています。 KJWはNIH助成5T32EY013933と5T32DK007647-20でサポートされています。 VBMは、NIHの助成金K08EY020530によってサポートされています。

1。網膜下注入用デバイスを組み立てる<ol><li>ガラス毛細管の直径100μmの針を購入したりします。これは、サッター、P-97ピペットプラーまたは他の類似の装置を使用して手動で行うことができます。それが所望の直径（100μm程度）に達するまで、キャピラリーチューブの端を加熱し、プルアップされます。直径の小さい針が遺伝子治療ベクターを使用することができますが、これは、細胞または目に損傷を与えることなく、細胞注入のための推奨径である。鋼針に比べ、ガラスキャピラリーニードルは網膜破損を引き起こすことなく、注射液および網膜下腔へのアクセスの可視化を可能にするために、非常に細かいですが、鈍先端を持っています。 70％エタノールを使用して必要に応じてこれらのプルアップ針をクリーニング後、滅菌容器に保管してください。所定の位置に針を保持するためにテープで15センチメートル滅菌組織培養皿は、注射針が覆われており、無菌環境を保つために1つの方法です。この時点で、COMPL手続きが行われる手術室の中にセットアップをETE。それは、この手順はバリア施設内で行われている場合は特に、無菌のままにするために、すべての回で手術室にすべての機器を維持するのが最も簡単です。 </li><li>注射針にシリコーンを吸引除去し、針の内壁に沿ってコーティングを残すためにシリコーンを取り出します。シリコーンコーティングは、特に内側のガラス毛細管壁を突き刺すような針の穴を介して細胞やウイルスの通過を最大化します。 </li><li> （チューブから針を取り除く）を直接針の後のポイントでルアーロックで設定した25¾ゲージ採血を切断することにより滅菌したプラスチックチューブの約8cmの長さを取得します。 </li><li>滅菌生理食塩水で1mlサブQ 26 5/8-gaugeスリップオンチップシリンジを記入し、注射器から針を外します。 </li><li>プラスチックチューブの切断端に注射針を取り付け、他にルアーロックにシリンジを取り付ける終わり。 </li><li>それが正しく漏れなくても接続されていることを確実にするために針を介していくつかの生理食塩水を取り出し、チューブやキャピラリーニードル内のデッドスペースを埋めるために滅菌生理食塩水を吸引します。次に、注射針の先端に、空気の小さい、約1μlの量を吸引除去する。これは、注入液から生理食塩水を分離し、外科手術中に注入流体の終わりを示す視覚的な手がかりを提供します。注入装置は外科手術の際に、70％エタノールで拭いてきれいな表面上に保持されるべきである。また、外科手術の際に使用されるすべての機器が既に滅菌、使用できる状態に保たれるべきである注射針の例外のために、70％エタノールで前と後の両方でクリーニングする必要があります。これらの針は、手術後の処分ではなく、再利用されるべきである。 </li><li>最後に、目的のパッケージ化された遺伝子治療ウイルスベクターまたは幹細胞を含む注射液を吸引除去する。これはによって行うことができますその後無菌細胞培養皿の表面に溶液をピペッティング、滅菌ピペットチップ内に注射液を取って。ソリューションは簡単にシリンジを用いて注射針内に吸引することができます。必要な量は、マウスの年齢によって異なります。私たちの目的のために、私たちは、注射液の0.5から0.8μlを注入することができる産後5日目のマウスを使用しています。少ない量、0.5μlの以下は、そのような1μlのように、若いマウスと多量に使用することができ成体マウスに使用することができます。細胞のウイルス力価または番号が注入されるウイルス/細胞およびそれらの所望の標的組織に基づいて決定する必要があり、少量のようにあまりにも多くのウイルス粒子または細胞が網膜細胞に対して毒性につながることができます。ビデオでは、可視化の目的のために、我々は、1.5μlの、眼の中に注入するのに必要以上の色素を多量に使用してきました。 </li></ol> 2。網膜下腔へのアクセス<ol><li>無菌手術室の中では、マウスの年齢によって異なりますが、ローカルで承認された動物取扱業者のプロトコルに従ってマウスを安定させるか、または麻酔。成体マウスのための一般的な麻酔はイソフルランガスまたは滅菌生理食塩水でケタミン（100 mg / ml）とキシラジン（20 mg / ml）を0.1 ml/10g体重の腹腔内注射の使用を含む。周産期のマウスの場合、一般的な麻酔技術はイソフルランガスまたはcryoanesthesia（低体温）の使用を含む。すべての麻酔技術は、使用前にお近くの動物実験委員会の承認を得なければならない。同様の技術はP0または成体マウスへの幼いマウスに適用することができますが、我々は一般的に、（P）は産後5日目のマウスを使用しています。外科的処置は、マウスが手足を動かすことがなくなるまで開始され、もはやピンチをつま先に応答しないことはできません。血液の流れが遅くなりますので、周産期のマウスのために、彼らは、彼らは麻酔下で完全であることを知ることに別のキーカラーで目立って軽くなるだろう。 </li><li>周産期のマウスでは、mにVannasまっすぐはさみを使用オーケ閉鎖蓋裂に沿って約1.5 mmの切開。目が自然に将来で開きますインデント、でカットするように注意してください。これは蓋を癒すとマウスの開発中に正常に開くことが保証されます。我々は、彼らがこの手順の間、目に穴をあけることのリスクを軽減するので、Vannasはさみを好むものの、外科ブレードは、この目的のために使用することができます。ビデオでは、はさみは眼瞼縁に沿って直接穿刺し、カットに使用されていました。このテクニックを学ぶときに、鉗子は、切断前にまぶたを持ち上げ、目を損傷する危険を軽減するために使用されるべきである。 </li><li>目をproptose、それは注射用proptosed保持するために眼の下にわずかにまぶたを挟まないように湾曲したドレッシング鉗子でまぶたを引き離す。ステップ2で作った蓋切開が大きすぎると、目蓋の下に逆戻りし、注入手順中に適切な露出を防ぐことができます。成体マウスでは、DRと目の周りのわずかな圧力を適用することディエッサー鉗子は、注射用proptosed目を保持することができます。 </li><li>小さな強膜における切開または15度のマイクロサージェリーの刃で表面を傷つけによって地球の赤道より後方を確認します。この切開は、注射針の先端を通過するのに十分なだけ大きいが、それよりも大きくなければならない。望ましい場合には、そのような鍼治療の針のような小さな、鋭い針ではなく、マイクロサージェリーブレードの網膜下腔にこの切開を作るために使用することができます。暗く着色された動物では、暗褐色の色素組織（脈絡膜·網膜色素上皮）は、切開した時点で見えるようになります。軽い色素沈着またはアルビノマウスでは、手術用マーキングペンは切開部位を示すインクスポットを残して顕微ブレードの先端に適用することができます。切開部位からクリア（硝子）流体還流した場合、ブレードがあまりにも深く置かれ、硝子体腔および治療ウイルスまたは細胞は注入時に硝子体内にスペースを入力することが入力されました。 visualizati用目的のために、我々は、ビデオのこのポイントへの切開を行った。それは、この場合の網膜下注入を完了することは可能ですが、注入流体の存在によって引き起こされる網膜剥離は完全にこのマウスで治癒しない場合があります。したがって、注意が注射前に網膜を通して眼としないの外表面部のみを切断するために注意しなければなりません。 </li><li>慎重に切開部位に注射針を挿入し、網膜下のスペースを入力するには、外側の目の壁に平行して進める。眼内外壁に近すぎたり深すぎて前進すると、誤った場所への注入を指示します。針が正しい場所にあるかどうかを理解する最良の方法は、技術を練習することです。軽く色素沈着またはアルビノマウスで練習すると、網膜下空間に精密かつ正確な注射を作るのを助けることができます。針と注射液が、これらの目の中で目に見えるであるためです。 </li><li>シリンジプランジャに軽い圧力を適用し、ある所望の流体のジン注入。針が正しく網膜下空間内に配置されている場合は、適度な背圧が感じられるだろう。針がガラス質内にある場合には、注入時の有意に低い背圧と潜在的にいくつかの流体の逆流があるでしょう。重要な背圧がある場合は、ゆっくりと針を取り外す前に、少なくともさらに15秒間の場所に針を保持します。これは、高眼圧が切開部位バックアウト注入ウイルスまたは細胞を還流するのではなく均一にすることができます。空気と生理食塩水の一部は、注入手順時に必要な圧力上昇に起因する網膜下腔に注入してもよい。ケアは、それは目から注入されたウイルスまたは細胞を洗い流すことができるので、空気又は生理食塩水を過剰に注入しないように注意するべきです。これは、網膜下腔に注入しすぎて流体の存在から永久網膜剥離を起こすことも可能です。可視化の目的のために、余分な染料と空気がint型に注入したビデオの中の網膜下腔をO。これは明らかに気泡が網膜下空間内に留まると硝子体の中に消えていませんどのようにあまりにも多くが注入されている場合、色素の一部が網膜下腔の裏にフラッシュされますどのように見られるが、することができます。これは、これらの注射は、眼の正しい場所にあるすべてだったことを強調するために使用されていたので、人は針が切開部位を入力する必要がありますどのように視覚化することができます。網膜下腔に全ての注射は、注射液の存在に起因する一時的な網膜剥離を起こす。注入手順が正しく完了している場合は、この一時的な網膜剥離はすべてのそれ以上の実験のために使用することができます24時間とマウスで治るでしょう。目は外科手術に起因する約1週間柔らかいままである可​​能性がありますので、二回目の注射は、この期間中は避けるべきである。 </li><li>新生児マウスについては、そっとふたの後ろと軌道に戻って目をプッシュするために湾曲したドレッシング鉗子を使用しています。それが役に立つかもしれませんウイルスが網膜下空間内で安定するよう、ゆっくりと、その軌道に戻って目を押したときに、それが切開部位からフラッシュされることがないようにするために分を待つ。手術後、25ゲージ針から無菌の生理食塩水に0.25％に希釈した0.5％の一滴ブピバカイン（marcaine）が注射部位に配置することができます。マウスは、網膜下手術後の苦痛の明白な徴候を示していないと長時間作用型外用鎮痛ブピバカインとしての使用は、過去3年間のための十分なされています。このような感染症、腫れ、またはマウスの通常の日常活動の低下など、マウスは常に苦痛の兆候を探すために外科手術後に監視する必要があります。これらが発生した場合は、獣医師に通知されるべきであり、このようなブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を、さらなる痛みの治療薬は、腹腔内注射として与えることができます。 </li><li>局所的に承認された動物の取り扱いプロトコルに従って麻酔からマウスを覚ます。マウスは加熱pに保たれるべきであるそれは麻酔から目覚めるように正常な体温を維持するための広告。手術は麻酔を受けるために、マウスのための時間をカウントしない、完了するまでに5分未満を取る必要があります。したがって、加熱パッドは、実際の手順の実行中に必要ないのですが、手続きは時間の長い期間を取ることができるように1つのテクニックを学習している間必要になることがあります。それは自分自身で移動し始めているまで、マウスはクリーンケージに戻されるべきではない。新生児については、穏やかなつま先のピンチは完全に麻酔から回復するために彼らのために役立ちます、そして、彼らは母親と一緒に戻って配置される前に、そのピンクの色と動きを取り戻す必要があります。以前に記載されているマウスは、苦痛の形跡がないかを経時的にモニターする必要があります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このビデオ技術は、正常に網膜下注入外科手術を完了し、遺伝子治療ベクター又は幹細胞を効率的に眼疾患を治療するために必要な場所に配置されていることを確実にする手順について説明します。それはこれらの細胞の周辺に遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織を置くので、この技術は、そのようなRPEまたは光受容体として網膜細胞のターゲティングを可能にします。従来の方法?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 0.8から1.10 x 100 mmのキャピラリチューブ（ガラス） </td><td>キンブルグラス株式会社</td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td><td>サター·インストゥルメント</td><td> P-97 </td><td>ナリシゲマイクロフォージを代わりに使用できます。カタログ＃MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> SL2-25ML </td><td>シリコーン</td></tr><tr><td> Dubeccoのリン酸、塩化カルシウム、塩化マグネシウムと緩衝生理食塩水</td><td> GIBCO-Invitrogen社</td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td>安全ロク3/4G 25×12 &quot;、血のコレクションセット</td><td> BDバキュテイナー</td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1ミリリットルサブQ 265/8Gスリップチップシリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5から10μlのフィンピペットIIの可変ボリュームピペッター</td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1から200μlのナチュラル面取りヒント</td><td>米国サイエンティフィック株式会社</td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8ステレオ顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60ミリメートル×15 mmのスタイル処理されたポリスチレン細胞培養皿</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannasストレートはさみ</td><td>シュトルツ眼科</td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td>繊細な鋸歯を有する湾曲したドレッシング鉗子</td><td>シュトルツ眼科</td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15度マイクロサーナイフ</td><td> Wils眼科株式会社に</td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td> Ketaset III </td><td> NADA＃45から290 </td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド研究所</td><td> NADA＃139から236 </td><td></td></tr><tr><td>ブピバカイン（Marcaine） </td><td>アストラゼネカ</td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

失明は、米国で約340万人に影響を与え、今後数年間で増加すると予想される。最近1、遺伝子治療や幹細胞移植は、網膜変性疾患に起因する失明を治療するための重要な治療手段となっています。そのような虹彩色素上皮細胞移植などの加齢黄斑変性症（AMD）に対する自家移植のいくつかの形態、有望な結果を生成しており、ヒトでの臨床試験は、遺伝子や幹細胞治療の他の形態のために始めている。2これらはRPE65遺伝子の交換を含むレーバー先天性黒内障とスタルガルト病で、ヒト胚性幹（ES）細胞を用いたRPE細胞移植患者における治療3-4現在の遺伝子治療ベクター及び網膜疾患患者の治療に利用できる幹細胞が存在すること、それは確認することが重要である適用する前に、動物モデルにおいて、これらの潜在的な治療法ヒトでの研究でそれらをING。マウスは眼の遺伝子治療用ベクターと幹細胞移植の治療効果をテストするための重要な科学的なモデルとなっている。このビデオの記事では5月8日 、私たちは、網膜下腔への遺伝子治療ベクター又は幹細胞を注入する手法を提示マウス眼周囲組織への損傷を最小限に抑えることができます。

マウス眼の描画は硝子体内注射し、網膜下の両方の外科的処置（矢印、 図1）の場所を表示する矢印で、参考のために標識された主要な構造体で示されています。そのようなlacZのレンチウイルスベクター（ 図2）のような遺伝子治療ベクターは、これらの場所を使用して注入することができる。さらに、このようなマウス胚性幹細胞（ 図3）などの...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K ビュー.  Columbia University. この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。

ビデオ: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

医学

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

マウス網膜神経節細胞における遺伝子発現のための子宮内および生体外でのエレクトロポレーションで

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

生物学

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法<i&gt;経由で</i&gt;経強後方アプローチ

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

網膜変性マウスモデルにおける網膜下移植片の経瞳孔ガイド下経強膜移植

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...