細胞型と発達段階特有のプロファイリングにブキャナン-ウォラストンラボでの作業は、欧州委員会の第 6次フレームワークProgammeにおけるアグロ-OMICSプロジェクト（グラント＃LSHG-CT-2006から037704）によってサポートされています。細胞型に特異的なプロファイリングのギフォード·ラボでの作業はBBSRC新治験助成（BB/H019502/1）によってサポートされています。 KC274とKC464 シロイヌナズナラインはAAR·ウェッブ（ケンブリッジ大学）から得た。

1。プロトプラストの生成<ol><li>かみそりの刃で1ミリメートル幅のストリップ（ 図1）への収穫葉材料とカット。のために最大15葉に単一のリーフ以上を含有するサンプルを簡単にカットする前に積み重ねることができます。 </li><li>直ちに20mlの溶液 （400mMのマンニトール、20mMのMES水和物は、20mMのKCl、10mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2、0.1％BSAおよび2.5mMのβ-メルカプトエタノールを含む9センチメートルラウンドペトリ皿に葉片を転送protoplasting酵素を含むpHは5.7）（1.2％セルロース、R-10、0.6％セルロースRSと0.4パーセントmacerozyme R-10）とRNase及び転写酵素阻害薬（1×ProtectRNAおよび10μg/ mlのアクチノマイシンD）;優しく独立した葉片と真空度は2×5分間浸透させる。 </li><li> 3〜4時間室温およびプロトプラストを90 rpmに設定オービタルシェーカー上にシャーレを置きます。 <ol><li>インキュベーションの間葉片は、使用することによって、互いに分離されるべきである30分ごとの間隔で、フラットピンセットのセットです。 </li></ol></li><li> 50 mlチューブで70μmのセルストレーナー（フィッシャーサイエンティフィック）を置き、そっとを通じてprotoplastingソリューションをフィルタリングします。これは、プロトプラストが通過できるようにしながらふるいによって保持される葉片を、削除されます。 </li><li>ゆっくりとフィルター同じ篩4 mlの溶液を用いて葉片を洗浄します。 </li><li>丸底チューブにプロトプラストを転送し、ペレットプロトプラスト〜5分間300 xgでプロトプラスト溶液を遠心分離します。 </li><li>穏やかにプロトプラストを乱すことなく、できるだけ多くの上清を可能な限りを吸引。 </li><li> 、遠心分離機で5分間300 xgで5 mlの溶液を用いてプロトプラストを洗浄します。上清を除去</li><li>パスツールピペットやカットオフP1000チップを使用して、 ソリューションの適切な音量でプロトプラストを懸濁する。 </li></ol> 2。葉プロトプラストのFACS </p&gt; <ol><li>すぐにソートする前に、凝集プロトプラストを避けるために（ノンカット）P1000チップを用いてプロトプラストを再懸濁します。 </li><li> 50μmのfilconフィルター（BD Biosciences社）をソートチューブにプロトプラストを転送し、セルソーターのノズルの目詰まりを避けるために、必要に応じて希釈してください。プロトプラスト（これらの設定は、BDの流入セルソーターに最適な20 PSI（シース）と21から21.5 PSI（サンプル）、39.2 kHzの周波数と4000 &lt;事象発生率の圧力で100μmのノズルを使用してソートされます他のセルソーティング·マシン上（BD Biosciences社）。最適化）は、これらの設定を調整する必要があるかもしれません。 </li><li> GFP陽性プロトプラストを488nmのアルゴンレーザーを使用していて、30分の580バンドパスフィルタ（オレンジ）対40分の530バンドパスフィルター（緑）からの出力をプロットする識別されます。 GFP陽性プロトプラストは、高580 POPUの低530 /ロー580人口と瀕死/デッドプロトプラストと残骸の非GFPのプロトプラストと、高い530/low 580人口になりますlation（ 図2）。 <ol><li> RNAを抽出元となるプロトプラストをソートする場合、プロトプラストを還元剤（ 例えば 、β-メルカプトエタノール）を含む溶解緩衝液の少なくとも4つのボリュームに直接ソートする必要があります。また、単一試料のソート時間は、20〜30分であり、いずれかの時点で処理二から三のサンプルの最大値に制限されるべきである。 </li><li>ソートされたプロトプラストの可視化のために、プロトプラスト溶液の少なくとも8巻、その後プロトプラストを集中させる遠心分離によって収集に直接ソートする必要があります。 </li></ol></li></ol> 3。代表的な結果このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（ 図1）のために使用されるシロイヌナズナの葉からプロトプラストを得るための方法を説明します。 RNaseおよび転写阻害剤の存在下におけるプロトプラストの生成は細胞fを防ぎromは転写応答をマウントする。これは、自家蛍光の有意水準を持っている多くの死者と瀕死プロトプラストを生じさせるの結果を持っていません。この方法を用いて調製したプロトプラストをソートする場合には、ソートに使用される580nmの対530nmの蛍光のグラフにはいくつかの異なる集団を参照することが非常に一般的です。このプロトコルに使用されるソートゲートと一緒にこのような例は、 図3に示します。 プロトプラスト溶液の8巻にソートされ、濃縮を確認するために可視化のために収集することができます。 図2Gは、これは孔辺細胞にGFPを発現TP382ラインを使用しての例を示しています。 増幅前と後の両方で、この方法を用いて得られた収量の例は、 表1に示されている。算定された金額は、オベーションピコWTAのシステム（500 PG-50 ng）を、したがって、sを用いて増幅するために十分である定量PCR（ 図4）は、次世代シーケンシングやマイクロアレイのいずれかの方法でubsequent分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> 図1実験の全体的なワークフロー。 1）収穫はシロイヌナズナラインをGFP発現から関心のある葉。 2）迅速に約1mm幅のストリップに切断し、直ちにprotoplasting溶液及び真空浸透させるにこれらを転送します。 3）3〜4時間インキュベートする。 4）70μmのふるいを通してゆっくりと濾過プロトプラスト溶液を遠心分離により底チューブ、ペレットプロトプラストを丸める移す。 5）すぐに選別、再懸濁するプロトプラストおよびフィルタは50μmを通じて選別チューブに移す前に。 6）並べGFP陽性およびGFP陰性の実行可能なプロトプラスト。 7）プロトプラストは今どちらか視覚的に分析したり、そのような定量PCR、次世代シーケンシングやマイクロアレイなどの技術を使用して設定できます。 図2本研究で使用したKC464、KC274とTP382行。向軸表皮にGFPの発現を示すKC464葉のA）の横断面。 B）のプロトプラストはKC464葉由来。血管系にGFPの発現を示すKC274葉のC）の横断面。 D KC274葉由来）プロトプラスト。孔辺細胞におけるGFPの発現を示すE）TP382の葉。 F）のプロトプラストは、TP382の葉に由来する。 TP382葉由来プロトプラストの高い530/low 580集団からプロトプラストを含むGFPを示し、葉の細胞の複雑な背景に孔辺細胞をGFP発現のFACSによって得られた濃縮のG）の例。 AF：共焦点顕微鏡画像、G：蛍光顕微鏡画像。画像内のスケールバーは50μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> 図3 30分の580 nmの（オレンジ）対40分の530 nm（緑）バンドパスフィルタ（BDの流入のセルソーター）からの出力の典型的なFACS買収ドットプロット。示さソートゲートは通常、ソート時に使用されたものである。単一の低530/low 580人口を示す阻害剤の非存在下でprotoplasted COL-4葉由来プロトプラスト、、のA）ドットプロット。阻害剤によるストレスや着色のために580蛍光のシフトを示す阻害剤の存在下でprotoplasted重量COL-4葉由来プロトプラスト、AからB）ドットプロット。高530/low 580集団で集団を含むGFPを示す阻害剤の存在下でprotoplastedそれぞれKC74、KC464とTP382ライン、、、から葉由来プロトプラストからCE）のドットプロット。 GFP（高530/low 580）集団内のイベントのパーセンテージが与えられている。 <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 e_content &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> 図4：図3に示すように、代表的なゲーテッド人口画分におけるGFP発現。複製し2つの生物学は、その後行われたGFP特異的プライマー（ 表2）を用いてオベーションピコWTAのシステムと定量PCRを用いて増幅し、各分画の種類が得られた。示された値は、最も高い（赤）、最低（緑）と平均相対値である。高580人口はこのケースでは2、低530/low 580と単一の生物学的replicateは、単一の値のみが表示されているので、使用されていたため高530/low 580に分割されました。 ACT2（At3g18780）は、すべてのサンプルのための標準として用いた。葉：葉全体。未ソート：ソートされていないプロトプラスト。 GFP1：高530/low 580とRest1：低530/low 580、GFP2：高530/high 580とRest2： 図3とインサートで説明したように、低530/high 580、。結果は、検証Oアールソートされた画分（ 例えば、 図2G）におけるGFP細胞含量のf光学評価。 <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> 葉数 </td><td> 細胞数 </td><td> RNAの収量 （NG） </td><td> RNAの収量 （増幅; NG） </td></tr><tr><td>全体の葉 全葉B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td>ソートされていないプロトプラスト ソートされていないプロトプラストのB </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152年*** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 Rest1 </td><td> 15 </td><td> 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337（1.49％*） 62405（73.49パーセント*） </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> 表1サンプルは、FACSを用いて収集し、ライブGFP発現プロトプラストを含有する画分を決定するために、定量PCRで分析した。またオベーションピコWTAシステム（NuGen）で増幅前後NGの総RNAの収量は、この表に含まれています。 GFP1、GFP2、Rest1とRest2画分を、 図4中の挿入で表示されます。総細胞ソート実行の細胞の*割合は分数のセルの数の横に括弧で与えられます。これらのパーセンテージはに相関していない収集レスト細胞のはるかに大きい数のためのGFP画分よりも早く停止したFACSの並べ替えなど、各サンプルのお互いが &#39;休息&#39;分数のために実行されます。製造元のプロトコールに従って増幅反応への入力として使用** 50 NG、。 <table border="1"><tbody><tr><td> プライマー </td><td> シーケンス </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> 表2定量PCRプライマー。

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特別な利害関係は宣言されません。

我々は、プロトプラストの生成およびFACSを使用して後続の細胞選別のための葉にGFPを発現するシロイヌナズナ植物の使用を可能にする方法を説明してきました。この方法は、定量PCRやマイクロアレイのどちらかによって増幅、したがってその後の分析に使用するRNAの十分な量が得られます。ソートされた画分を、高度として定量PCR（ 図2）によって実証GFP含有細胞が濃縮されています。 葉片が阻害剤含有プロトプラスト溶液を真空に潜入されるまで生きてプロトプラストの高い収率を達成するには、手順の最初のステップの間に急速に働くことが重要です。また、1ミリメートルの葉片を生成するときに、これは過度の損傷、したがって低いプロトプラスト収量につながるとして、葉ではなく &#39;チョップ&#39;やマッシュにスライスまたはカットすることが非常に重要です。 ここで説明した方法と他publisheの決定的な違いdの方法はRNase阻害剤や転写阻害剤の使用です。ほとんどのメソッドは、プロトプラストをより簡単に生成することができ、そこからシロイヌナズナの根のために開発されています。しかし、肉を除いて、葉を扱うとき、それはプロトプラストの生成時間を増加させる必要がある。したがってプロトプラストの生成処理自体（データは示していない）の結果として、遺伝子発現の変化から守るために、これらの阻害剤を含めることが重要です。しかし、阻害剤の存在は、ストレスに対抗すると可塑性の喪失にこのリード線などのプロトプラストが受けやすくなる可能性のあるもの、オンまたはオフの遺伝子を切り替えることにより、どちらかの、転写応答をマウントすることができないことにつながる手順をprotoplasting。 我々はGFP発現シロイヌナズナライン数で正常ここで説明した方法を使用している。重要なのは、我々はどちらかに強くGFPを発現するGFPの行でこのメソッドを使用している核、またははるかに弱くnon-localized/diffuse細胞質方法では、ここで使用されてKC464とKC274線の場合と同様です。回線の両方の型は、メソッドと互換性があり、GFP発現プロトプラスト（ 図2および3）の高濃縮画分を得ることができます。フルオロフォアは、生きた細胞を選択する能力を維持するために死んだ/死細胞の自家蛍光とは著しく異なる蛍光を選択しなければなりませんが、方法は簡単、他のフルオロフォアに適合させることができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>セルラーゼR-10 </td><td>メルフォード</td><td> C8001 </td></tr><tr><td>セルラーゼRS </td><td>メルフォード</td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td>メルフォード</td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R7397 </td></tr><tr><td>アクチノマイシンD </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td>フィッシャー</td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50μmのfilconカップ型フィルター</td><td> BD Biosciences社</td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

cell specific analysis of arabidopsis leaves using fluorescence activated cell sorting

葉の原基の開始後、バイオマス蓄積は主に細胞増殖や葉1の拡大によって制御されます。しかし、 シロイヌナズナの葉は、多くの異なる細胞型といくつかの構造で構成された複雑な器官である。同時に、成長して葉が拡大停止と老化1を受けることが第一である葉柄から最も遠いセルと、開発のさまざまな段階で細胞が含まれています。リーフ内の異なる細胞が故に伸長または分化、分裂している、アクティブ、ストレスやデッド、および/または任意の一時点で、携帯型のサブ組での刺激に応答します。これはやりがいの葉のゲノム研究を行います。たとえば全体の葉から発現データを解析する際に、異なる細胞応答ゾーンまたは細胞型で動作遺伝子ネットワークからの信号が生成される不正確なプロファイルになり、混乱します。 この問題に対処するために、Sエベラル方法は細胞特異的遺伝子発現の研究​​を可能が記載されている。これらは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）2またはプロトプラストの生成とそれに続く蛍光活性化細胞選別（FACS）3,4、原子力降水5とポリソーム6の免疫沈降のための最近記載そのままシステムに使用されるGFP発現植物が含まれる。 FACSを成功裏に根端からセルの識別情報との距離が遺伝子3,7の多数の発現プロファイルに有意な効果を持っていたことを示すなど、多くの研究が、使用されてきました。 GFPの行のFACSもroot窒素応答と側根の発達8、塩ストレスルート10の9オーキシン分布の間に細胞特異的転写調節を実証し、 シロイヌナズナの茎頂分裂組織11の遺伝子発現マップを作成するために使用されている。しかしFACSが以前自家蛍光12,13に基づくシロイヌナズナ葉由来プロトプラストをソートするために使用されてきたが、葉にGFPを発現シロイヌナズナライン上のFACSのこれまでの利用は4非常に限られてきました。以下のプロトコルでは、プロトプラストの生成レジームの影響を最小限に抑えながら、FACSと互換性のあるシロイヌナズナの葉のプロトプラストを得るための方法について説明します。我々は、向軸表皮14にKC274線、血管組織14とダブルGFPは内核局在化シグナルにリンクされている構築物を発現TP382 シロイヌナズナライン入力で GFPを発現するが、KC464 シロイヌナズナラインを使用する方法を実証しているGFPを発現する孔辺細胞（データは示されていない、 図2）。我々は現在、老化のさまざまな段階で、両方の細胞型の開発とストレス時の具体的な表現だけでなく、不均一な細胞集団を研究するためにこのメソッドを使用している。

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Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

製造方法<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;特定の細胞集団の研究を可能にする、蛍光活性化細胞選別（FACS）と互換性のある葉プロトプラスト。このメソッドは、任意のと互換性があります<em&gt;シロイヌナズナ</em細胞のサブセットでGFPを発現&gt;行。

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

15.2K ビュー.  University of Warwick. 製造方法シロイヌナズナ特定の細胞集団の研究を可能にする、蛍光活性化細胞選別（FACS）と互換性のある葉プロトプラスト。このメソッドは、任意のと互換性がありますシロイヌナズナ行。

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

発生生物学

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

生物学

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

の細胞特異的な分析

要約

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共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

時空のCaを測定する

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

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