作者は感謝して工科大学ブラウンシュヴァイク、ドイツで &quot;遺伝子から製品への&quot;共同研究センターSFB 578を介してドイツ研究協会（DFG）による財政支援を認める。

1。栽培の原子炉のセットアップおよび開始合計4つのバイオリアクターの栽培が行われています。 <ol><li> Aの栽培に2.2 Lの作業ボリュームで3 L攪拌タンクバイオリアクターを使用して、 ニジェール SKAn1015。 </li><li>反応器に72.6グラムのグルコース一水和物を注ぐと1.9 Lの脱イオン水でそれを埋める。 </li><li>例えば、3バッフル、2つの6枚羽根ディスクタービンインペラ、pH電極、エアフィルター、冷却指、エアフィルター、エアフィルターの無菌サンプリングのための液浸管と排気クーラーガス入口として原子炉装置の設置培地、接種、酸と塩基およびインレットホース。 </li><li> 20分間121℃で反応をオートクレーブ。 </li><li>酸 - 塩基貯蔵（2 M塩酸、2 M水酸化ナトリウム）とそれに対応するポンプを原子炉に接続し、pH制御ユニットと5.0のpH値±0.05を設定します。 </li><li>冷却水システムで原子炉をリンクし、加熱ジャケットを置く原子炉容器の周り。 </li><li>対応する制御ユニットと温度センサーを取り付け、37の温度を設定±0.1℃の温度制御ユニットで。 </li><li>原子炉の上に攪拌モータに合わせて、200 min -1の撹拌速度でサービスにそれを持って来る。 </li><li>滅菌インレットホースの滅菌最小限の成長媒体11トラフ1（250 mL）を追加します。培地調製のためのすべてのコンポーネントが20分間121℃でオートクレーブと一緒に混合した。 3栽培のためのコンポーネントが1グラム/ L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）の濃度タルク粉末（3MgO•4SiO 2•H 2 O）が含まれています。使用する前に、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）のマイクロ粒子を再懸濁および滅菌培地に追加します。コントロール培養で（粒子なし）の50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）によるマイクロ粒子懸濁液を交換してください。 </li><li>胞子懸濁液（接種）を追加sはウーハーペニヒらに用意しました。ら（2011）11そのトラフ滅菌インレットホース（50 mL）の1その1X10 6 mLの-1に胞子量の濃度。接種は、栽培開始（H = 0 h）をマークします。 </li><li> 1.0 L min -1の速度で通気を開始します。 </li></ol> 2。 24、48、72栽培の時間後に無菌サンプリング<ol><li>小瓶チューブに無菌培養液50mLを取る。 </li><li>バイオマス乾燥重量、β-フラクトフラノシダーゼ活性の測定と顕微鏡分析用のサンプルを使用しています。 </li></ol> 3。 24時間、48時間および72時間後の栽培バイオマス乾燥重量の測定<ol><li>バイオマス試料は、少なくとも二重に取られることです。 </li><li>重量デシケーター中で乾燥後、マイクロスケールのセルロースフィルターと接続された水ジェット真空ポンプをブフナー漏斗にフィルタを配置します。 </li><li>定義されたサンプル量（例えば10 mL）でフィルタリングndはバイオマスから培地化合物を除去するために10 mLの脱イオン水でフィルターを洗浄してください。 </li><li>しわフィルタ一度途中で、ガラスのペトリ皿に入れて体重不変（少なくとも24時間）までコンパートメント乾燥機に入れます。 </li><li>デシケーター中でフィルタを冷却して重量を測定します。 </li><li>使用されるサンプルの体積で割った乾燥バイオマスの有無にかかわらず、フィルタの重量の差としてバイオマス乾燥重量を計算します。 </li></ol> 4。 24時間後GOD / POD-エッセイによるβ-フラクトフラノシダーゼの細胞外酵素活性の測定、48、栽培の72時間一緒に働きながら常に氷上でサンプルを格納します。 <ol><li>フィルタ1.5 mLの培養懸濁液トラフ反応管にフィルターを介して注射器で培養懸濁液を押すことにより、セルロースアセテートフィルター。使用するまで-20℃で反応管を格納します。 </li><li>反応混合物の使用20サンプルμLおよびスクロースからグルコースへの反応を開始するには0.05 Mリン酸緩衝液（pH 5.4）に溶解した1.65 Mショ糖の200μLを追加します。少なくとも複製に反応出キャリー。 </li><li>加熱ブロックで20分間40℃で反応混合物をインキュベートします。加熱ブロックで10分間95℃でインキュベートして反応を停止します。氷の上にそれを格納することによって、反応混合物を冷却し、4℃で10分間13.000グラムで遠心分離によって凝縮水をスピンダウン℃に</li><li> pHとグルコース、ショ糖の温度依存性の切断を考慮して、20μLの脱イオン水の代わりに、20μLのサンプルを使用してブランク値を実施しています。 </li><li>培養液中の残存グルコースを考慮して、各サンプルの負の制御を行う。そのエンドユーザーによる使用20種類のサンプルのμL及びスクロースを追加し、ステップ4.3で説明をインキュベートする前に、10分間95°Cで加熱することによりβ-フラクトフラノシダーゼを失活させた。 </li><li>次のような測定そのサンプルの希釈ured吸着は、キャリブレーション値の範囲内です。 </li><li>三重のすべての酵素アッセイを実施しています。ウェルマイクロタイタープレートに2μL希釈したサンプルを適用します。代わりに2μLのサンプルの10個の異なるノウハウ濃度（1 mMから15 mMまで）で10グルコース溶液2μLを使用して、それぞれがマイクロタイタープレート上に校正用の標準の範囲を適用します。ゼロ点の校正は、2μL脱イオン水の代わりに2μLのサンプルを使用しています。 </li><li>マルチピペットを用いて各ウェルに試薬溶液200μLを追加します。 </li><li>室温で10分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 6でマイクロタイタープレートを保存する度測定（最大で数時間）までC。 </li><li> 96ウェルサンライズマイクロプレートリーダーとマゼランのデータ検索ソフトウェアを使用して450nmにおける吸収を測定します。最大5秒まで混合時間を設定します。最大1秒までと残りの期間。 </li><li>スプレッドシートと結果チャートを開き、標準の範囲を使用して検量線を作成する： グラムlucose濃度= 1 X + bの吸収 </li><li>アクティビティを計算します。 活動=（吸収X希釈因子ブランク値）X A + B </li><li>サンプルの活動と適切なネガティブコントロールとの差を計算することによって、β-フラクトフラノシダーゼの活性を把握する。 </li><li>アカウントバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼ活性を11にとることによって次のように使用するための特定の生産性を計算します。 </li></ol> 5。栽培の72時間後に顕微鏡や自動画像解析<ol><li>場所は約3 mLの培養プラスチックペトリ皿中の懸濁液と形態学的構造が分離されるまで、生理食塩水でそれらを希釈してください。 </li><li>内蔵または接続されているカメラを備えて顕微鏡下でペトリ皿を置く。サンプルあたりの形態構造の約100の画像（ 図2）を取得して保存します。各画像に少なくとも一つのオブジェクトが完全に描かれていることに注意を払う。 </li><li>画像処理プログラムImageJは12と同じサンプルのすべての画像を開きます。プロセスツールの&quot;Makeバイナリ&quot;（ 図2）を使用して白黒に画像を変換します。画像のシリーズ全体にコマンドを適用するため、次のようにマクロのコードを使用します。 実行（、、バイナリを作る&quot;） </li><li>再びImageJを使用して処理バイナリイメージを開きます。形状因子フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、分析ツールの &quot;Set測定&quot;を持つすべてのイメージのための真円度のundの堅牢性を計算します。セリにコマンドを適用するための画像のESは、次のようにマクロのコードを使用します。 ラン（ &quot;8ビット&quot;）; ラン（ &quot;バイナリを作成します&quot;）; 実行（ &quot;SETスケール...&quot;、 &quot;距離= X知られている= 1000ピクセル= 1単位=ミクロングローバル&quot;）; （ &quot;セットの測定...&quot;、 &quot;領域境界形状フェレの上限の表示は=なしの小数= 3をリダイレクトする&quot;を参照）を実行; （ &quot;粒子を分析...&quot;、 &quot;サイズ= 10000無限の真円度= 0.00から1.00のshow =表示をアウトライン&quot;）を実行します。 スケールバーを越えて直線を作成することにより、1000μmのに相関画素数としてXを決定します。 μmの中のスケールバーの長さの直線の画素数を関連付けることができます。 </li><li>スプレッドシートと各画像の形状係数の値を含む結果チャートを開きます。画像ごとに次のように形態の数を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li>の値と考慮つのサンプルのすべての画像を取って形態番号の標準偏差を意味します計算します。 </lI&gt; <li>特定の生産性モルフォロジー数のグラフィカルな相関のグラフとデータ解析プログラムを使用して、数学的回帰による数学的関係を決定します。 </li></ol> 6。代表的な結果タルク微粒子Aの追加によりニジェール SKAn 1015形態が真のペレット形態から分散した、あるいは菌糸の形態に変更されます。ペレットの形態は、標準的な条件で展示されているのに対し、菌糸形態がタルク微粒子の10グラム/ L（ 図4）と培地の補充によって作成されます。同時にβ-フラクトフラノシダーゼの活性は3倍3から5の周りに増加します。タルク粉末の1または3 g / Lの補充は倍増フラクトフラノシダーゼ活性（ 図4）と、分散した形態につながる。 マイクロ粒子依存形態を包括的にモルによって記述することができる自動画像解析によって決定されるパラメータを使用して計算することができます。phology番号を指定します。完璧なラウンドと滑らかなペレットは顕微鏡画像で完全な円として表示されます。このような粒子のために形態番号が1の値を持ちます。菌糸形態の最小フラグメント0の形態の番号を得、一次元のラインのように簡略化することができます。細長い不規則なペレットまたは塊のようなすべての中間の形態学的形態は、したがって、0と1の間の値を持ちます。かなり大きな粒子はかなり低い形態番号11で、大規模な表面または細長い粒子と高い、真菌の粒子になります。 標準状態で原子炉1の形態は、展示約0.8モルフォロジー番号を入力します。 10グラム/ Lタルク粉末を反応器4の形態は、0.1の周りにMnを備えています。 1と3 g / Lのタルク粉濃度の原子炉2および3の形態の数は、分散したモルフォを実証し、これらの両極端の間にあるでれっと。ミクロ粒子に依存する形態が密接にβ-フラクトフラノシダーゼの生産性と関連しているので、形態の番号と図5と同様の生産性の数学的な相関が得られます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> 図1実験デザインと分析手順の全体的なスキーム。A.ニジェールは、72時間タンクバイオリアクターの攪拌3 Lに（微小粒子の有無にかかわらず）栽培されています。 24時間後、48と72ヘクタールのサンプルは再び、特定の生産性の計算に使用されているバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼの活性の測定のために取られています。 48時間後に菌の形態を顕微鏡で検査され、デジタル画像解析を特徴とする。画像解析の関連するパラメータは、数学的な特定の生産性と相関している形態の番号に結合されています。 <imgALT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Aから形態学的構造の微視的生成された画像の画像処理のステップニジェール 。ステップ1：顕微鏡による画像取得。ステップ2：イメージの改善、必要に応じて。ステップ3：Ima​​geJのでは生成された画像の二値化、白黒（バイナリ）の画像。ステップ4：バイナリイメージによって処理され、不要なオブジェクトがクリアされます。ステップ5：形態素解析は、オープンソースプログラムImageJの &quot;分析粒子&quot;関数を使って行われている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> 図3。 A.別の形態形追加されたマイクロ粒子の濃度に依存するニジェール 。微小粒子の濃度の増加とともにペレットのサイズは正確に小さなコア·シェル型ペレット、小さな群れも自由に分散した菌糸体にまで減少させることができるようにした。としての形態エンジニアリング液内培養におけるマイクロ粒子補給によってpergillusニジェールSKAn1015。微粒子（）は10 mg / L（B）、0.1グラム/ L（C）、0.2グラム/ L（D）、0.3グラム/ L（E）、0.6グラム/ L（F）、1.0グラム/ Lなし（G）、1.5グラム/ L（H）、2.0グラム/ L（I）、2.5グラム/ L（J）、3.0グラム/ L（K）、3.5グラム/ L（L）、4.0グラム/ L（M ）、4.5グラム/ L（N）、5.0グラム/ L（O）、10グラム/ L（P）、15グラム/ L（Q）、20グラム/ L（R）、30グラム/ L（S）と40〜50グラム/ L（T）。画像は、栽培の72時間後に光学顕微鏡で撮影された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 図4の依存性のフラクトフラノシダーゼ活性のタルク微粒子濃度を1g / L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）。原子炉1は、微小粒子を添加したされていません。ここで栽培は、標準的な条件下で実施されています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> 図5の形態の代表的な良好な相関（R 2 = 0.91）番号と特定の生産性。形態番号は、特定の生産性（縦軸）に対して（横軸）にプロットされています。非線形回帰は指数の相関が得られます。

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

私は、開示することは何もありません。

菌類の形態の変更は数十年以来、バイオテクノロジーで注目されている。別の研究では、対照的に、pH値、電源入力、温度、培地の栄養素や接種濃度1として選択されたプロセスパラメータを変更しようとしたが、形態のむしろ不正確、不完全なコントロールに苦しんで、高いエネルギーコスト、抑制効果や製品の不安定ましたマイクロ粒子の補充は、粒子サイズと濃度の微調整の変動を介して菌の形態の正確なエンジニアリングを可能にします。これは、最適化のためにとAと生物工学的生産で高い生産形態のオーダーメイド設計のためのミクロ粒子を使用する新たな可能性を開きます。 ニジェールや他の糸状微生物。 デジタル画像解析は、真菌マクロ形態を特徴づけるための簡単​​な再現可能な方法です。しかし、サイズ、形状、表面特性のパラメータの様々な文献に記載されている形態学的構造のTERは、真菌形態の迅速な評価は複雑になります。関連するパラメータの組み合わせとして提示形態番号は、この欠点を回避し、形態学的構造の総合的特性評価のためだけでなく、生産性との直接的な数学の相関だけでなく、使用することができます。これが再び与えられた形態によって生産性の推定をレンダリングするため、プロセスの形態のカスタマイズが可能必要があります。 形態番号を使用して、それは様々なペレットと塊の形態4,5とを区別することが可能です。形態数の更なる発展のためにフラクタル次元の検討は有望と思われる。フラクタル次元は、オブジェクト13のプロパティを充填複雑さと質量の測定を提供し、したがって、菌糸形態の全体的な特徴付けのためにあらかじめ定めています。 CR菌糸生長フォームは以前にはるかに大きいの培養液の粘度2を示すことが示されているため、高い生産菌糸形態のeationは、しかし、特に大規模栽培でのプロセスのパフォーマンスの問題につながる可能性があります。これは、熱伝達や物質移動と高い電源入力を必要とし、1を動作させる栽培を行うとコストが高く停滞し、非混合ゾーンの形成の問題につながります。したがって、真菌の形態と培養液の粘度との関係は、形態を変更するときに考慮する必要がありますし、さらにモデルに組み込まれる。

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

糸状菌A.ニジェールは、食品から医薬品業界への工業的プロセスの広い範囲で広く使われている株である。この糸状菌の中で最も魅力的な、しばしば手に負えない特徴の一つは、その複雑な形態です。それは緻密な球状ペレットから粘性の菌糸体（ 図1）の範囲である。さまざまなプロセスパラメータと成分は菌類の形態1に影響を与えることが知られています。最適な生産性は、特定の形態学的形態と強く相関するので、菌の形態は、多くの工業生産の生産性のボトルネックを表しています。 正確に形態学的形状を制御するために、まっすぐ進むと、エレガントなアプローチでは、増加した酵素の生産2-6貢献培地に無機不溶性微粒子（含水ケイ酸マグネシウム、酸化アルミニウムやチタン、ケイ酸、酸化など）の追加です。 OBVがあるので、マイクロ粒子依存の形態と酵素生産との間のIOUの相関は、それが数学的に生産性と形態学的外観をリンクすることが望ましい。したがって、定量的な正確かつ包括的な形態学的な説明は、対象としています。 そこで、生成し、特徴づけるミクロ粒子に依存する形態学的構造を、おそらく糸状微生物の形態形成の理解に貢献する生産性（図1）真菌の形態を相互に関連付ける方法を提案する。 組換え株のA.ニジェール SKAn1015はタンクリアクターの攪拌3 Lで72時間栽培されています。 g / Lの事前接種に1グラム/ L、3グラム/ Lと10の濃度タルク微粒子の添加により形態学的構造の様々な再現性が生成されます。滅菌した試料は、酵素生産の成長の進捗状況や活動を決定するための24時間、48時間および72時間後に採取されています。ザ形成された製品は、高付加価値酵素β-フラクトフラノシダーゼ、中でもグルコース7-9ショ糖の反応を触媒する食品や製薬業界におけるネオ糖形成のための重要な生体触媒である。したがって、ショ糖を加えた後、グルコースの定量化は、生産β-フラクトフラノシダーゼの量を意味します。グルコースの定量は、96ウェルマイクロタイタープレートでハイスループット分析のために変更されたGOD / POD-アッセイ10によって行われます。 72時間後の菌の形態を顕微鏡で調べ、デジタル画像解析によって特徴付けられる。そうすることで、フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、真円度のundの堅実さのような真菌のマクロ形態の粒子の形状因子は、オープンソースの画像処理プログラムImageJを用いて計算されています。関連するパラメータは、包括的な特性評価を可能にする無次元形態番号（Mn）が11に結合され真菌の形態。形態番号と生産の密接な相関関係は、数学的回帰で強調表示されます。

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

正確に生成すると総合的に糸状菌の形態を特徴づけるための方法<em&gt;アスペルギルスニジェール</em&gt;形態学的外観と生産性の数学的な相関を可能にする、説明されています。

のカスタマイズアスペルギルスニジェール</emタルク微粒子を添加することによって>モルフォロジー

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

19.1K ビュー.  Technische Universität Braunschweig. 正確に生成すると総合的に糸状菌の形態を特徴づけるための方法アスペルギルスニジェール形態学的外観と生産性の数学的な相関を可能にする、説明されています。

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

免疫・感染学

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

要約

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包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

バイオセーフティレベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染

のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

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フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

バイオセーフティレベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染