1。ゲルの調製<ol><li>三角フラスコにアガロースの適切な質量を量る。アガロースゲルは、AW / Vの割合のソリューションを用いて調製される。ゲルのアガロース濃度は0.5％-2％の範囲のほとんどのゲルで分離するDNA断片の大きさに依存します。バッファーの量は、フラスコの容量の1/3を超えるべきではありません。 </li><li>アガロース含有フラスコにバッファを実行して追加します。混合する渦巻。バッファを実行する最も一般的なゲルはTAE（40mMのTris-酢酸、1mMのEDTA）とTBE（45 mMのTris-ホウ酸、1mMのEDTA）である。 </li><li>アガロース/バッファ混合物を溶かす。これは最も一般的に電子レンジで加熱することによって行われますが、ブンゼン火炎を介しても行うことができます。 30秒間隔で、内容をよく混合し、フラスコと渦を削除します。アガロースが完全に溶解するまで繰り返します。 </li><li> 0.5μg/ mlの濃度にエチジウムブロマイド（EtBrを）を追加します。また、ゲルはまた、電気の後に染色することができ時間の長さが等しいためにバッファを実行する際に脱色続いて15から30分間、0.5μg/ mlのEtBrを含むバッファを実行しているで泳動。 </li></ol>注：EtBrをが疑われる発がん性物質であると正しく機関の規制ごとに廃棄しなければなりません。 EtBrを含むゲルを取り扱う際の手袋を常に着用する必要があります。 DNAの染色のための代替染料は使用可能ですがEtBrを、その感度とコストのために最も人気のひとつ​​です。 <ol start="5"><li>アガロースは、ベンチトップまたは65°Cの水浴中でインキュベートすることによりどちらかに冷却することができます。これを怠ると、ゲルトレイをワープします。 </li><li>鋳造装置にゲルトレイを置きます。あるいは、また、金型を作成するためのゲルトレイのオープンエッジをテープがあります。井戸を作成するためにゲル型に適切な櫛を配置します。 </li><li>ゲル型に溶融アガロースを注ぎます。アガロースは室温で設定することができます。櫛を削除し、ゲルボックスにゲルを置きます。また、Gエルは、ラップに包んで4℃で保存することができます°Cを使用する（ 図1）まで。 </li></ol> 2。ゲル装置およびDNA断片の分離の設定<ol><li> （ 図2）分離するDNAサンプルをロードする染料を追加します。ゲルローディング色素は、通常、6X濃度（0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノール、30％グリセロール）で行われています。ローディング色素は、あなたのDNAサンプルが旅してきたどこまで追跡するのに役立ち、また、サンプルがゲルにシンクすることができます。 </li><li>所望の電圧にプログラム停電電源装置（電極間1-5V/cm）。 </li><li>ゲルの表面を覆うために十分なランニングバッファーを追加します。ゲルを製造するために使用されるものと同じランニングバッファーを使用することが重要です。 </li><li>電源にゲルボックスのリード線を接続します。電源をオンにしてゲルボックスと電源の両方が機能していることを確認してください。 </li><li>蓋を外します。徐々にと慎重に（ 図3）ゲルにDNAサンプル（s）をロードします。適切なDNAサイズマーカーは、常に実験試料と一緒にロードする必要があります。 </li><li>ゲルボックスに蓋を交換してください。カソード（黒リード）は、陽極側（赤色リード線）よりも井戸でなければなりません。電極は電源の正しいスロットに接続されていることをダブルチェック。 </li><li>電源をオンにします。染料は、適切な距離に移行するまで、ゲルを実行します。 </li></ol> 3。分離したDNA断片を観察する<ol><li>電気泳動が完了したときは、電源をオフにして、ゲルボックスの蓋を取り外します。 </li><li>ゲルボックスからゲルを外します。ゲルの表面から余分なバッファを切る。余分なランニングバッファーを吸収するためペーパータオルの上でゲルトレイを置きます。 </li><li>ゲルトレイからゲルを外し、UV光にゲルを公開します。これは最も一般的なゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して行われます。 DNAのバンドが表示されるはずですアップオレンジ蛍光バンドとして。ゲルの写真（ 図5）を取ります 。 </li><li>適切にゲルおよび機関の規制ごとにランニングバッファーに廃棄してください。 </li></ol> 4。代表的な結果 図5は、PCR産物のアガロースゲル電気泳動後の典型的な結果を表します。分離後、得られたDNA断片は明確に定義されたバンドとして表示されます。 DNA標準またはラダーは、サンプルのバンドのサイズの便利な決定を可能にする程度に分離する必要があります。図示の例では、765 bpで、880 bpと1022 bpのDNA断片が2ログのDNAラダーと一緒に1.5％アガロースゲル上で分離されています。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> 櫛を除去した後の図1。固化したアガロースゲル。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> 図2学生は、彼女のDNAサンプルにローディング色素を追加します。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> 図3ゲルのウェルにDNAサンプルをロードする学生。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> 図4：ゲルドキュメンテーションシステムの例を示します。 <img alt="図5。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> 図5。ゲル電気泳動後の画像。 EtBrを1時間、100 Vで分離に続いて、0.5μg/ mlの最終濃度を電気泳動前にゲルに追加されました。ゲルをUV光およびゲルドキュメンテーションシステムで撮影した画像にさらされていた。

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

アガロースゲル電気泳動は、核酸を分離する効率的かつ効果的な方法であることが証明されています。アガロースの高いゲル強度は、大規模なDNA断片を分離するための割合が低いゲルの処理を行うことができます。分子ふるいは、ゲルマトリックス内のアガロース7のバンドルによって生成された細孔のサイズによって決まります。一般的に、アガロース、より小さい細孔径のより高い濃度である。従来のアガロースゲルは、100 bpと25キロバイトの間でDNA断片の分離に最も効果的です。 25キロバイトより大きいDNA断片を分離するために、1つは、2つの異なる方向からの交流電流のアプリケーションが含まれ、パルスフィールドゲル電気泳動法6を使用する必要があります。このように大きなサイズのDNA断片は、それらが現在の方向の変化に自分自身を再方向付けする速度で区切られています。 100 bp未満のDNA断片がより効果的にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離されています。とは異なり、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルマトリックスは、フリーラジカル主導の化学反応により形成されています。これらの薄いゲルは、高い濃度である垂直に実行され、良好な分解能を持っています。キャピラリー電気泳動シーケンシング現代のDNAが使用されているで、それによってキャピラリーチューブはゲルマトリックスで充填される。キャピラリーチューブの使用は、それによって迅速にDNA断片の分離（およびDNA配列の決定）を有効にする、高電圧の印加が可能になります。 アガロースは、ヒドロキシエチル化によって低融点アガロースを作成するために変更することができます。低融点アガロースは、一般的に分離したDNA断片の分離が望まれているときに使用されます。ヒドロキシエチル化が効果的に細孔サイズ8を減らし、アガロースバンドルの充填密度を減らすことができます。これは、同じ大きさのDNA断片は、標準的なアガロースゲルとは対照的に低融点アガロースゲルを介して移動に時間がかかることを意味します。バンドルには、お互いに関連付けるためそれが設定された後に非共有結合的相互作用9を介して、それが再溶解アガロースゲル電気泳動することが可能です。 EtBrを、アガロースゲル10でDNAを染色するために使用される最も一般的な試薬です。紫外線にさらされると、エチ分子の芳香環の電子は電子が基底状態に戻るようにエネルギーの放出（光）につながる、活性化される。 EtBrを、濃度依存的にDNA分子に自分自身を挿入することによって動作します。これは、その強度に基づいて、任意の特定のDNAバンドのDNA量の推定が可能になります。ため、その正電荷が、EtBrを使用すると、15％のDNAの移動速度を減少させる。 EtBrを容疑者変異原性と発がん性物質である、従ってそれを含むアガロースゲルを取り扱う際に一つ注意しなければなりません。さらに、EtBrをは有害廃棄物とみなされ、適切に廃棄する必要があります。アガロースゲル中のDNAのための代替染色はSYBRゴールド、SYBRグリーン、クリスタルバイオレット、メチルブルーが含まれています。これらの、メチルブルーとクリスタルバイオレットは、ゲルからDNA断片の回収が必要な場合は、それによって突然変異の確率を減少させる、DNAバンドの可視化のための紫外光へのゲルの露出を必要としません。しかし、その感度はEtBrをより低くなっています。 SYBR金とSYBRグリーンはEtBrをより低い毒性の両方で高感度、UV依存染料であるが、それらはかなり高価です。また、代替染料のすべてのことはできませんいずれか、またはゲルに直接​​添加したときにうまく機能しない、したがって、ゲル電気泳動後のポストで染色しなければならないでしょう。ので、コスト、使いやすさ、感度の、EtBrを、まだ多くの研究者のための選択の染料のままです。しかし、このような有害廃棄物処理が困難な場合や、若い学生である場合など、特定の状況で実験を行っている、毒性の少ない染料が好ましい可能性があります。 ゲル電気泳動に使用されるローディングの染料は、三大目的があります。最初に、彼らは、サンプルに密度を追加する、それがゲルにシンクすることができます。第二に、染料の色を提供し、ロード·プロセスを簡素化します。最後に、色素は、DNA断片が移行し​​た距離の推定を可能にし、ゲルを介して標準的な速度で移動します。 分離したDNA断片の正確なサイズは、各バンドが移動した距離に対するDNA基準の異なるバンドの分子量の対数をプロットすることにより決定することができます。 DNA標準では、未知のDNAサンプルと比較することができますあらかじめ決められたサイズのDNA断片の混合物を含んでいます。それはDNAの異なる形態が異なる速度でゲル内を移動することに注意することが重要です。スーパーコイルプラスミドDNAは、ため、そのコンパクトな立体構造の、最も遅い走行開いた円形のフォームと同じ大きさの直鎖状DNA断片、続いて、最速のゲルを通して移動します。 結論としては、DNAの分離のための1970年代のアガロースゲルを採用しているので、それが持つ生物科学研究の中で最も有用と多彩な技術の一つであることが証明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アガロースI </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>シグマ</td><td> E7637 </td><td>有害廃棄物として処分される発癌性、必要がある</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャー</td><td> BP2401-212 </td><td>腐食性の</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td>キシレン電子シアノールFF </td><td>シグマ</td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>シグマ</td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td>治験責任医師/ FXゲルドキュメンテーションシステム</td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td>フクロウEasycast B1ミニゲル電気泳動システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301電源</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

アガロースゲル電気泳動で100 bpから25キロバイト1までさまざまなサイズのDNA断片を分離する最も効果的な方法です。アガロースは、海藻テングサ属とオゴノリから分離され、繰り返しagarobiose（L-およびD-ガラクトース）のサブユニット2から構成されています。ゲル化時には、アガロースポリマーは、非共有結合的に関連付け、孔径ゲルの分子ふるい特性を決定するバンドルのネットワークを形成しています。アガロースゲル電気泳動の使用は、DNAの分離に革命をもたらしました。アガロースゲルの採択に先立ち、DNAは、主にのみサイズの近似値を提供してショ糖密度勾配遠心法を用いて分離した。アガロースゲル電気泳動を使用して、別のDNAに、DNAは、ゲルと印加される電流にプレキャストウェルにロードされます。 DNA（およびRNA）分子のリン酸バックボーンは負電場に置かれたとき、したがって、充電され、DNA断片は、pに移行しますositivelyアノードを充電されます。 DNAが均一な質量/電荷比を持つため、DNA分子が移動する距離は、その分子量3のログに反比例するようなパターンで、アガロースゲル内のサイズで区切られています。アガロースゲルを介してDNAの動きのための主要なモデルは、リーディングエッジが前方に移動し、4に沿って分子の残りの部分を引っ張ることにより、 &quot;レプにバイアス&quot;です。 2）アガロース濃度、3）DNAのコンフォメーション5、4）臭化エチジウム、6の電圧が適用され、5）が存在する）タイプのDNA分子の1）サイズ：ゲルを介してDNA分子の移動速度は、次の要素によって決まりますアガロースおよび7）電気泳動用バッファーの。分離した後、DNA分子は、適切な染料で染色した後、UV光下で可視化することができる。このプロトコルに従うことによって、学生のことができるようになります。 <ol><li> DNA断片をゲルマトリックス内に分離されているメカニズムを理解する</li><li>のコンフォメーション方法を理解するDNA分子はゲルマトリックスを通じて、モビリティを決定します</li><li>彼らのニーズに合わせて適切な濃度のアガロース溶液を識別する</li><li> DNAサンプルの電気泳動用アガロースゲルを準備します。 </li><li>ゲル電気泳動装置と電源を設定する</li><li> DNA断片の分離に適した電圧を選択します。 </li><li>エチジウムブロマイドはDNAバンドの可視化を可能にするメカニズムを理解する</li><li>分離したDNA断片のサイズを決定</li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。

DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

763.4K ビュー.  University of California Los Angeles. アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。

ビデオ: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

スマートフォンによるDNA断片分離のリアルタイム追跡

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

生化学

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

タンパク質の電気泳動分離

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

生物学

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

生物工学

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

DNAのゲル電気泳動

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Education

JoVE Science Education

基礎生物学

細胞および分子生物学の基本的方法

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

SDS-PAGEを用いたタンパク質の分離

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

ゲルを用いた精製

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

DNAアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

JoVE Core

分子生物学

ユニット 2

DNAとRNAを研究する

KEY TERMS AND CONCEPTS

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

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According to the manufacturer&#39;s recommendations, add agarose gel powder in 1x TBE buffer to reach 1.5 (weight/volume) percent, and heat to dissolve.
Prior to casting, tilt the dissolved gel solution briefly under running water. Add 5 microliters of fluorescent nucleic acid dye per 50 microliters of gel solution, and mix.
Assemble and level the casting tray. Add combs as appropriate for the number of samples. Pour the gel solution into the cast, and wait for it to solidify.
After that, submerge the cast containing the gel in 1x TBE buffer in a gel electrophoresis system. Mix 5 microliters of the PCR products together with 2 microliters of loading dye in new PCR strips. Transfer 5 microliters of the mixtures to the wells in the gel. Save at least one well empty. Add 5 microliters of DNA ladder in the empty well for reference.
Plug in the electrodes and run the gel at 110 volts per 15 centimeters for approximately 1 hour. Use a UV-based gel imaging system to verify the presence of multiple bands representing PCR amplicons.

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