1。細胞解離<ol><li>示されているプロトコルをまとめたフローチャートは、 図1である。このプロトコルを通して使用される特定の試薬 ​​のカタログ番号については、 表1を参照してください。 PBS浴中の網膜を分析。解剖中には、網膜が解離を阻害することができ、それらを維持するので、硝子体、レンズを取り外すことをお勧めします。網膜色素上皮（RPE）のすべてを削除するには、いくつかのインスタンスでは、それが完全にそれを削除することは不可能かもしれませんが常に非常に重要なことではありません。しかし、視細胞の単一細胞のプロファイリング実験のために、RPEを削除する必要があります。 RPEを削除に失敗すると、RPEに発現遺伝子を持つロッドセル·プロファイルの汚染につながる可能性があります。これは、おそらく感光体とRPEとの間の接続によるものです。 解離については、全体の大人のマウスの網膜は、20を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに10分間37℃でインキュベートするμlの活性化パパイン、5mMのEDTAの20μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した360μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）。フィルター付きピペットチップは、潜在的な汚染を最小限に抑えるためのプロトコル全体のすべての手順を実行するために使用されます。パパイン濃度とインキュベーション時間は、年齢や組織の性質に応じて異なります。たとえば、生後0日（P0）で分離された網膜を開発して解離し、10μlの活性パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で網膜をインキュベート37℃で10分間異なる種からの網膜もわずかに異なる条件が必要になります。鶏の網膜は、開発のほとんどの段階で、マウスの網膜よりも薄いです。 10μlの活性化パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および37℃で5分間、10mMのHEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）°Cを使用すると、tを解離するのに十分であるhese網膜。 </li><li>穏やかに、任意の和解の細胞を取り除くために、チューブをタップして、P1000ピペットで軽く10〜20倍粉薬。 37℃でさらに10分間インキュベート°C組織の大きな塊が10〜20倍を保持して再粉薬の場合。 </li><li> DNアーゼI（10 U /μl）を5μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 P1000ピペットで軽くひいて粉にする。回数の正確な数は経験的に決定する必要がありますが、一般的に10から20の間にあるでしょう。 </li><li> 3分間3000rpmでテーブルトップ遠心機で遠心分離し下部に液体の100〜200μlの溶液を残し、上清を取り除き、ペレットを取り除くために、チューブをタップします。 HBSS 1 mLを加え、穏やかな粉砕でペレットを再懸濁します。チューブをタップすると、単に網膜の細胞の多くを溶解してペレットを再懸濁し、ここが重要です。これが大人のマウスの網膜に特に当てはまります。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心分離し、慎重に含むPBS 450μlの上清と再懸濁しを削除するる0.1％BSA。それは、将来の反応を阻害することができた解離から溶解した細胞とされた製品からのmRNAの存在を最小限に抑えるためにできるだけ多くの上清を除去することが重要です。 </li></ol> 2。単一細胞を収穫<ol><li> 0.1％BSAを添加した5mlのPBSを含む2つの6 cmの皿を準備します。皿一皿の上に解離細胞と細胞が少なくとも5分のために解決することができます。使用される細胞密度は、プロファイルされ、単一の細胞の性質に大きく依存します。例えば、蛍光マーカーのようなGFPで標識された非常に希少な細胞のために、全体の解離網膜は、単一の6cmのディッシュ上に播種されています。やや豊富に存在する細胞については、より少ない細胞が最初にそれが簡単に第一マイクロピペットで1（または1に非常に近い）は、細胞を収穫できるようにメッキされています。 </li><li>倒立顕微鏡上に解離された細胞のプレートを置きます。我々は、オリンパスからIMT-2モデルを使用しています。 fiに描かれているマイクロピペットを用いてNEの先端（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）（ 図2）と一緒に吸引管とは、単一のセルを収穫。細胞は容易にそれが皿の上に近くに配置されているマイクロピペットを入力してください。それは吸引チューブが長すぎたり、倒立顕微鏡（私たちは倒立顕微鏡で使用する吸引チューブは38.1 cmの長さです）に関連付けられているステージまでの距離が短すぎるものでもないことが重要です。チューブが長すぎる場合、細胞をコレクションチューブにマイクロピペットから効率的に追放することはできません。我々は古いIMT-2モデル倒立顕微鏡を使用して主な理由は、我々はそれが私たちの吸引器アセンブリ管のステージに理想的な距離を持って発見したことである。マイクロピペットを入力した後、セル（またはセル）がただ一つの細胞が遺伝子発現プロファイリングのために採取されていることを確認する2番目の板（洗濯板）に追放されています。第二の板の上には、新しいマイクロピペットで余分な細胞を除去することがしばしば必要です。または、単一のセルはマイクロピペットに入ることを確認するために別の場所に興味のあるセルを移動します。 </li><li>個々の細胞が完全に隣接する細胞から単離されたとき、2.2節のように、目的の細胞を吸引するための新しいマイクロピペットを使用し、4.5μlのCell Lysis緩衝液を含む0.2ミリリットルのPCRチューブに直接排出します。セルは、チューブにマイクロピペットの先端を断つないように注意しながら、チューブの側に排出されます。サンプルは溶解バッファーで細胞を浸すためにベンチトップ遠心で簡単にスピンすることができます。この回転は、通常、単一細胞の分離の期間中に氷上で保存すべきである5回ごとにセルの後、再度溶解緩衝液中の単一細胞を含むcollection.Tubesの終わりに行われます。最適な結果を得るためには、単一の細胞は2時間のウィンドウをポスト解離内で収集されます。この時間が経過した後に追加の時間がobservされているので、それは逆転写のステップに進むために最適ですRNAの分解の可能性を高めるためにED。 </li></ol> 3。逆転写<ol><li>簡単にすべての単一の細胞は、細胞溶解緩衝液に浸漬されるようにベンチminicentrifugeでサンプルをスピン。細胞溶解を促進するために、90秒、70℃でサンプルをインキュベートする。サーモインチすぐに戻って氷の上にチューブを配置します。 </li><li> 2分間氷上でチューブを残します。すべての試薬の追加については、汚染を防止するフィルタチップピペットチップを使用しています。逆転写を行うために、0.33μlを上付き文字III（200 U /μl）を、0.05μlのRNaseインヒビター（40 U /μl）を0.07μlのT4遺伝子32タンパク質を追加します。 50℃50分℃でサーモに反応混合物をインキュベートします。氷上で15分、場所を70°C、酵素を不活性化する。 </li><li>無料のプライマーを除去するために、0.1μlのエキソヌクレアーゼバッファー（10X）、0.8μlののdH 2 0（分子生物学グレード）、0.1μlのエキソヌクレアーゼを追加するI（20 U /μl）を。で30分間37℃でインキュベートサーモ。 25分間80°Cで反応をインキュベートし、氷上でチューブを配置することによって酵素を不活性化する。 </li></ol> 4。テーリングとシングルセルPCR <ol><li>テーリング反応混合物の6μlを加え、10分間、20分間、70℃、37℃でサンプルをインキュベートするためにサーモを使用して、4℃で保持°C </li><li> PCR反応混合物につかれた試料の10μlを追加し、次の条件を使用して第二鎖の合成とPCR増幅を行います。 <ol><li> 2分間95°C </li><li> 5分間37°C </li><li> 16分72°C </li><li> 40秒で93°C </li><li> 1分間67°C </li><li>サイクルあたり6秒を追加し6分間72℃、 </li><li> 4 34回に進みます</li><li> 10分間72℃ </li><li> 4℃で保持°C </li></ol></li></ol> 5。アフィメトリクスチップのラベリング<ol><li> cDNAのラベル10から20μgの（増幅したcDNAの結果の濃度単一のセルからるは、通常、Affymetrix社のマイクロアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを取得する）は1μg/μlを〜です。最初に、断片液80に8μlの1XワンPhor - すべてのバッファおよび希釈液1μl（1Xで1:10ワンPhor - すべてのバッファ）DNaseIにより、単一細胞cDNAの10から20μlを加えることによってcDNAを反応。 37℃で13分間サーマルサイクラーでインキュベート℃の100°Cと氷の上の場所で15分間のDNase Iを失活さ。 </li><li> 20μlの5倍のTDTのバッファー、2.5μlのビオチンN6-ddATP（エンツォバイオサイエンス）、1μLTdTとの（TDTバッファーで1:8に希釈）を追加します。 </li><li> 65℃、5分間℃、37℃で90分間インキュベート-20℃で保存またはアフィメトリクスマイクロアレイにすぐにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、標準Affymetrix社のプロトコルを使用して実行されます。 </li></ol> 6。代表的な結果評価するために、cDNAサンプルのcDNAを、10μlの品質は、1％アガロースゲル上にロードされています。 cDNAは、主にサイズの範囲（500から2000塩基対）によって判断されるcDNAのスメアのと強度（ 図1および図3a）。図1に示したゲルでは、他のすべてのレーンはE16.5を単離した網膜細胞からのcDNAスメアを示しています。の間のレーンは針に吸引し、PCRチューブに堆積され、メディアのみ生じるスミアが表示されます。これらのレーンは、かすかな汚れを完全に欠いていることは決してありませんが、遺伝子特異的PCRプライマーは、それらの遺伝子を増幅するために使用されている場合、彼らはすべての結果が表示されません。さらに、cDNAのスメアの強度は、（ 図1および図3aを比較）多少異なる場合があります。レーンA、B、C、D、Eはかなり少ない堅牢ている間、図3aのレーンでは、f、g、およびhは、堅牢なcDNAのスメアが含まれています。 遺伝子特異的PCRを用いて、単一細胞からのcDNAの質の二次スクリーニングとして使用されます。 図3のcDNAを蛍光網膜神経節細胞から単離し、それらはtesteあったdは、網膜神経節細胞マーカーBrn3bとPax6のためのPCRプライマーを使用します。このアッセイでは、cDNAを1μlのは30サイクルのPCRを行った。リアルタイム定量PCRアッセイが望ましいであろうが、それは法外に高価であると単にcDNAの品質を評価する必要はありませんができます。単一細胞の全8 Pax6の（ 図3b）のうち8 Brn3bと6の陽性反応を示した。 Brn3bとPax6のために以下の堅牢な生産バンドであったとしてもcDNAのスメア。これらのPCRの結果にもかかわらず、そのようなレーンA、B、C、D、およびEにあるようなcDNAのスメアは、Affymetrix社のアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを生むとは限らないと一般的に回避されるという我々の経験である。光受容体マーカーCRXのための遺伝子特異的PCRは、単一細胞cDNAを（ 図3b）の汚染レベルを決定するために使用されていました。これらの細胞は網膜の大半（約70％）を構成し、したがって、発生した細胞溶解が最も可能性の高いロッドフォトレジストを含んでしまうため、感光体マーカーが選ばれましたceptors。 CRX存在のかすかな量があっても、PCRの30サイクル後、これらのcDNAの調製のみであった。最後に、このPCRベースの画面がcDNAは完全なマイクロアレイプロファイリングにそれらを施す前から派生した特定の細胞型のどのサブセットを決定するために開始するために使用することができます。これは、このプロセスの中で最も高価なステップであるように、プロファイルされたセルの優先順位付けに役立てることができます。たとえば、我々は遺伝子Tachykinin1（ 図3b）の存在のためにそれらをスクリーニングすることによって、網膜神経節細胞のサブセットを同定した。 小型のPCRベースの画面から、特定の単一のセルが選択され、そのcDNAは、Affymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズした。マイクロアレイデータが比較され、パターンは、標準的なクラスタリングアルゴリズムを使用して発見することができます。このような図4のようにヒートマップは、データをグラフィカルに表現するために生成されます。 図中の単一細胞のプロファイリングデータに関する2つの主要な結論があります4。単一細胞のプロトコルが実行された後、最初に特定の細胞型で発現される遺伝子は、これらの細胞型でほとんど独占的に発見された。 1つの細胞型のマーカー遺伝子は双極細胞は第二の細胞型で、この式は容易にその場でいずれかの方法で確認され、低いレベルでいくつかの&quot;ロッド&quot;の遺伝子を発現するような観察 ​​第二の細胞型でも発見されたほとんどのインスタンスでハイブリダイゼーションまたは抗体染色。第二に、より多様なアマクリンおよび神経節細胞プロファイル内で、遺伝子発現の不均一性は直ちに明らかである。 Nr4a2とScube2が異なるアマクリン細胞で均一に発現される遺伝子の2つの例である一方Pou4f1にのみ、開発神経節細胞の約1/4で表されます。数百の遺伝子が開発神経節細胞のマーカーとして、あるいは2,4 -アマクリン細胞の異なる集団のマーカーとして同定され、確認されているとして、実際には、ヒートマップに示される遺伝子は、小さなサンプルです。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> 図1。単一細胞のプロファイリング方法のフローチャート。まず網膜を単離し、パパインを使用して、個々の細胞に解離する。第二に、単一の細胞が引っ張らガラス針で採取し、PCRチューブに堆積される。細胞を溶解し、cDNAをPCRに続いて逆転写を用いて増幅されています。得られたcDNAの品質は、当該示すようなアガロースゲル上で評価される。最初のレーンでDNAラダーの後、レーンには、メディアコントロールからの増幅産物と交互に（赤い括弧で示される）単一細胞からcDNAスメアを示しています。この品質の塗抹標本（赤括弧）はAffymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> 図2。針や吸引チューブアセンブリの写真。単一細胞の毛細管現象を用いて分離されているガラスマイクロピペットを（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）引っ張られ、アスピレーターに吹くの圧力によって転送されます。それは吸引チューブが簡単に操作することは十分に長いと確実に個々のセルを放電するのに十分短いの両方であることが重要である。針に引き込ま毛細管のクローズアップビューがBに示されている<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> 図3。単一細胞cDNAスメアと遺伝子特異的PCRの代表的な例を示します。増幅後のcDNAを単セルの品質を決定するためには、各単セルのサンプル10μlのネガティブコントロール（）と一緒に1％アガロースゲル上で実行されました。塗抹標本では、500から2000塩基対の間に表示されます。特定の遺伝子の追加のPCRベースのスクリーニングは、単離された細胞の種類とサンプル（B）に存在する汚染の量を識別する/確認することができます。網膜神経節細胞に特異的なプライマーは、Brn3bマーカーとPax6のは、これらの細胞（行1および2）の身元を確認するためにテストされました。準備中、感光体汚染の量を評価するために、感光体マーカーCRXに特異的なプライマーは、（行3）を使用した。神経節細胞のサブセットはまた、Tachykinin1（行4）などのマーカーのスクリーニングによって同定することができる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> 図4。マーカー遺伝子の単セルの式22の異なる単一細胞で発現し、選択した遺伝子のマイクロアレイ結果をヒートマップ形式で表示されます。マイクロアレイ信号から強度が赤色の強度に対応するようにスケーリングされています。黒は、マイクロアレイ上の信号の有無を示しています。他の細胞は成人の網膜から単離した間に示すように網膜神経節細胞（RGC）の前駆体は、胚の時点から単離した。

<ol>
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U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li><li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells.">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li><li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells.">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159 (2006).</li><li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development.">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. 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利害の衝突が宣言されません。

研究の拡大を続ける数は、その遺伝子発現6,8に関してより均一であると考えられていた集団での強固な細胞間の変動を明らかにしています。少なくとも一つのインスタンスで、この遺伝子発現の&quot;ノイズ&quot;が重要な生物学的機能13を果たすことが示されている。個々の細胞間の遺伝子発現の違いは、伝統的な全体の組織の方法を使用して隠されている。これらの実験は、?...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

細胞の高度に専門化が、非常に小さな集団が多くの組織で重要な役割を果たしている。非常にまれな細胞サブセットの細胞型特異的マーカーと遺伝子発現プログラムの識別は、標準的な全体の組織のアプローチを使用して挑戦されています。個々の細胞の遺伝子発現プロファイリングは、全組織1-7のわずかな割合を構成する細胞の種類に前例のないアクセスを可能にします。さらに、この手法は、一時的に8の動的発達遷移中に細胞の小さな数字で表現される遺伝子発現のプログラムを調べるために使用することができます。 携帯電話の多様性のこの問題は、ニューロンの接続が非常に多様な細胞が9との間に発生する可能性があり、中枢神経系（CNS）で繰り返し発生します。異なる種類の細胞の正確な数は正確に知られていないですが、それは皮質私のように多くの1000などの異なるタイプが存在する可能性があることと推定されているtself 10。複雑な神経回路の機能（s）はまれな神経細胞の種類とそれらが発現する遺伝子の一部に依存する場合があります。新しいマーカーを同定し、分子の異なるニューロンを分類するために助けることによって、単一セルのアプローチは、神経系の細胞型の解析に特に有用である。それはまた、神経前駆開発の初期段階で示差的に発現する遺伝子や遺伝子経路を識別することによって、神経発生のメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。 かなりの神経細胞の多様性を持つ単純な、簡単にアクセス組織として、脊椎動物の網膜は、細胞の開発、神経分化と神経多様化のプロセスを研究するための優れたモデルシステムです。しかし、中枢神経系の他の部分のように、この細胞の多様性は、特に桿体は、MAを作ることを考えると、特定の細胞の運命を採用する網膜前駆細胞を駆動する遺伝的経路を決定するための問題を提示することができ合計網膜細胞集団11のjority。ここでは、単一網膜細胞（ 図1）で表される転写産物を同定するための方法を報告します。単一細胞のプロファイリング技術は、網膜2,4,5,12の異なる細胞集団内の異質性の存在量の評価が可能になります。さらに、このメソッドは、細胞の運命は、網膜前駆細胞のサブセット8で発生するプロセスを意思決定の役割（複数可）を果たす可能性がある新たな候補遺伝子の宿主を明らかにした。プロトコルにはいくつかの簡単な調整で、このテクニックは、多くの異なる組織および細胞型に利用することができる。

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K ビュー.  Iowa State University. 単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。

ビデオ: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...