<p class="jove_content"&gt;著者は、フローサイトメトリー解析とソーティングと彼らの支援についてジェニファー·ストレンジとグレッグ·バウマンに感謝したいと思います。この作品は、NCRRからNIHグラント番号2P20 RR020171によってサポートされており、FMにケンタッキー大学のスタートアップ資金によりされた。GIEは、大統領大学院フェローシップとケンタッキー州の機会奨学金の支援を承認します。</p

1。バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離<ol><li>病院や近くの血液センターの場所からバフィーコートのいずれかの単位を取得します。私たちの血液センターでは、正常な血液ドナーから得た単位当たりのバフィコートの約40〜60 mLで提供してくれます。 </li><li>バフィーコートを希釈するために滅菌したPBSを含むオートクレーブ500mLのガラス瓶に血液を注ぐ。 PBS +バフィーコートの最終容量は250mLのでなければなりません。 </li><li> 20 mLのLymphoprep溶液を用いて各10 50mLのコニカルチューブを埋める。 </li><li>優しくLymphoprep解決を邪魔しないように注意して、希釈したバフィーコートの25 mLのLymphoprepソリューションを重ねる。 </li><li> 500×gで室温で30分間チューブをスピン。リンパ球分画を邪魔しないようにするように、遠心機のブレーキをオフにしていることを確認してください。 </li><li> Lymphoprepとピペットを用いてプラズマ媒質層との界面でのPBMCを収集します。約1mLまでプラズマ媒質をオフに吸引まだPBMCを含むバフィーコート層をカバーしています。新しい50 mlチューブにPBMCを転送するために10 mLのピペットを使用しています。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄し、血球を計数するための冷RPMI 50mlに細胞を再懸濁します。 1×10 9 PBMCを-典型的な回復は8×10 8である。 </li></ol>この手順は、血液の小さなボリューム用にスケールダウンすることができます。全血サンプルの希釈は、PBSで1:1です。 2。合計CD4の磁気負の選択+ T細胞、CD4 + CD45RA +ナイーブT細胞またはCD4 + CD45RO + EasySep濃縮キットを使用してPBMCからのメモリーT細胞が（幹細胞技術） 4.25×10 8末梢血単核細胞〜1×10 8のために従うべき手順を実行します。 <ol><li> 2％FBSおよび1mMのEDTAを含むPBS中でmL当たり5×10 7の最終濃度にPBMCを再懸濁します。新鮮な14 mLの丸底ポリプロピレンチューブに細胞を移動します。 <ol clasS = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> 合計ヒトCD4 + T細胞の負の選択によるの単離：ヒトCD4 + T細胞の濃縮抗体のカクテル（PBMCのmL当たり50μL）、混合し、室温で10分間インキュベートを追加します。 </li><li> 負の選択によるヒトナイーブT細胞の単離：PBMC細胞懸濁液、ミックスのmL当たりの抗CD45RO抗体50μLを加え、室温で15分間インキュベートします。キット（PBMCのml当たり50μL）、10分間室温で混合し、インキュベートで提供される濃縮カクテルを追加します。 </li><li> 負の選択によるヒトメモリーT細胞の分離は、人間の記憶CD4 +抗体のT細胞の濃縮カクテル（PBMCのmL当たり50μL）、ミックスを追加し、室温で10分間インキュベートします。 </li></ol></li><li>同様に、ソリューション全体に配布するだけでなく磁性粒子を混ぜ合わせます。渦ナノ粒子は、ナイーブなキットからしないでください。 </li><li>磁性粒子（合計100 CD4ためのPBMCのmL当たりμL+とナイーブT細胞の選択、メモリーT細胞選択のためのPBMCのmL当たり50μL）を追加します。優しくナイーブT細胞の選択やメモリまたは合計CD4 + T細胞選択のための5分間、10分間室温で2〜3倍とインキュベートをピペッティングにより混和する。 </li><li> PBSアップチューブあたり10 mLにボリュームを持って来るために2％FBSおよび1mM EDTAを含む追加します。静かに合計CD4 + T細胞、ナイーブおよびメモリーサブセットは、それぞれ5、10または2.5分間銀EasySep磁石に上限なしチューブを配置する前に2〜3回ピペッティングして混ぜる。 </li><li>まだEasySep磁石のチューブで、興味のある細胞を単離するために、新しい50 mlチューブに液体を注ぐ。 </li><li>ステップ2.5と優れた回復のための2.6を繰り返します。 </li></ol> 3。調節性T細胞を誘導する細胞培養条件<ol><li>第一抗CD3抗体を希釈することにより、ステップ1と2、コート組織培養プレートの前日（滅菌PBS中の1μg/ mLの濃度にOKT3クローン）。 6ウェルプレートはPBSを2mL +ウェルあたり抗CD3を追加するために、12ウェルプレートに1 mLを加え、または24ウェルプレートのウェルあたり500μLを追加します。コー​​ティングしたプレート4℃で使用するまで保管してください。 </li><li> RPMI-1640 2.06 mMのグルタミン-Iおよび25 mMのプリ補足し、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン及び50μMβ-メルカプトエタノール、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加することにより偏光媒体を準備します。 HEPES緩衝液。次に、2 ng / mLのTGF-β、5 ng / mLのIL-2を追加します。ここで、一つのメディアに関心のリガンド又は阻害剤を追加することができます。偏光媒体の2×10 6細胞/ mLの濃度で、ステップ2から細胞を再懸濁します。 </li><li> 37前のウォームプレート°Cとセルを追加する前に、抗CD3でコーティングされた井戸のPBSを吸引除去する。 12ウェルプレートまたは24ウェルプレートの細胞を1mLの細胞の2mLを、6ウェルプレートに4 mLのウェルあたりの細胞懸濁液を追加します。の蒸発を減らすためにPBSで空の井戸を埋めるメディア。 37℃/ 5％CO 2で3日間インキュベートします。 </li><li> 3日後めっきでは、500×gで5分間遠心分離にプレートをスピンダウンする。プレートの下にT細胞に影響を与えずに、メディアの半分を削除し、新鮮な培地と交換します。井戸が細胞（3×10 6個 / ml以上の濃度）で過密になった場合あるいは、同様に別の抗CD3コートプレートにボリュームを分割し、元のボリュームに戻って新鮮な培地を追加します。 37℃/ 5％CO 2で二から三日以上インキュベートします。 </li></ol> 4。 T細胞の3つの集団の蛍光活性化セルソーティング（FACS） <ol><li>滅菌したPBSに0.5％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTAを加えることにより洗浄バッファーFACSを準備します。 4の場所バッファは°C、コールド取得します。 </li><li>ウェル細胞培養液から細胞を除去し、完全な細胞の回復を確実にするためにPBS 2mLで各ウェルを洗浄してください。 50 mLのポリプロピレンチューブ内のすべてのセルを配置し、10、500 xgで遠心分離分4℃で</li><li>細胞密度を決定するために血球の細胞をカウントします。 </li><li>補償制御のための4つの独立した5 mLの丸底ポリスチレンチューブ内の場所チューブあたり3〜5×10 5細胞を。 50 mLのポリプロピレンチューブ、チューブあたり以上35以上×10 6細胞の残りのセルを配置します。 </li><li> 4°Cと吸引メディアで5分間、細胞をスピンダウンする。 1×10 6細胞当たりの冷洗浄緩衝液90μLにソートする細胞を再懸濁します。冷洗浄緩衝液100μLの補償制御チューブに再懸濁します。 </li><li>ソートする細胞に、抗CD25-PE、1×10 6細胞当たりの抗CD127-APCの抗CD45RA-PE-Cy5で、1μLの3μLの2μLを兼ね備えています。第四管に抗CD127-APCの第3のチューブAND1μLにPE-Cy5で-第1の補償制御管、第二の管に抗CD25-PEの2μL、抗CD45RAの3μLにない抗体を加えなかった。暗闇の中で45分間氷上でチューブをインキュベートします。 </li><li&gt;はソートするセルと補償制御チューブに1 mLに冷洗浄緩衝液10mLを追加します。 4℃で5分間、500 xgですべての細胞を遠心℃、 </li><li>洗浄緩衝液のmL当たり1×10 7個の細胞の濃度でバッファと再懸濁し、細胞を吸引除去する。 40μmのナイロンセルストレーナーでろ過する前に、細胞のmL当たりのDNase IIの1.5μLを追加します。チューブあたり以上3.5未満mLで、複数の5 mLの丸底ポリプロピレンチューブに細胞を移動します。洗浄バッファー300μLで補償制御の細胞を再懸濁します。 </li><li> PE、APCとPE-Cy5のフィルタによってゼロクロス検出を最小限に抑えるためにMoFloフローサイトメーターで補正を設定します。 1 mLの新生仔ウシ血清を含む5 mLの丸底のポリスチレンチューブにT細胞、ナイーブ（CD25-CD45RA +）とメモリ（CD25 - - CD45RA） - iTregs（細胞CD25 こんにちは CD127 -/LOW CD45RA）をソートするためにゲートを設定します。 </li></ol> 5。抑制アッセイ<ol><li> supprを作るessionアッセイ100 U / mLのペニシリン、ストレプトマイシン100μg/ mLで、5 ng / mLのIL-2およびTGF-βにAIM-Vの2 ng / mLを加えることによってメディア。 </li><li>手順1および2に示すように、アッセイの日は、異種のCD4 +バフィーコートからT細胞を精製する。これらは抑制アッセイの標的細胞となり、 図2、0日目に見られるように、CD25 + Treg細胞が含まれていません。 </li><li>代わりに2μLの細胞のmL当たり5 mMのストック溶液のわずか1μLを用いて除いては、製造元の指示に従って、CellTraceキットのラベル細胞。直接光から出たまま、5 mMのストック溶液を作るためにCFSE 1バイアルにCellTraceキットによって提供されるDMSOの18μLを追加します。 1×10 6細胞/ mlの最終濃度になるように温めておいたPBS + 0.1％（w / v）のBSAにおける標的細胞の必要な数（1×10 7の最大数まで）に再懸濁します。細胞のmL当たりの5mM CFSEの1μLを加え、5 minut、37°C​​の水浴中でインキュベートES。染色を急冷し、氷上で5分間インキュベートし、10％FBSを完全に、氷冷RPMI 5ボ​​リュームを追加します。風邪完全RPMIと抑制アッセイ培地100μLあたりに再懸濁し、1×10 5細胞で2回以上の細胞を洗浄します。 </li><li> Tregの抑制インスペクタビーズは 2×10 7ビーズ/ mLのストック濃度である。ペレット、ビーズの数は、エッペンドルフチュー​​ブ内で簡単に遠心分離して実験ごとに細胞の総数に等しい。 RPMIおよび再ペレットで一回ビーズを洗浄します。 RPMI吸引した後、再懸濁し、ビーズはとてもよく当たりビーズの適切な量の抑制アッセイ培地の8μLであることを。 </li><li> 96ウェル丸底組織培養プレートに、希望するターゲットにCFSEで染色した細胞（1×10 5細胞/ mL）を、インスペクタビーズや新鮮な抑制アッセイ培地の偏光およびソート細胞（1×10 5細胞/ mL）を追加（CFSE染色）：200μLの最終容量でエフェクター（ソート）の比率。すべての条件がtripliに設定されているケイツ。 </li><li>ウェルあたり92μL抑制アッセイ培地にCFSE染色した細胞、インスペクタビーズの8μL、新鮮な、染色細胞の1×10 5の100μLを加えることにより二つの制御条件の最初の準備をします。上記のようなものインスペクタビーズのTregせずに、同じ細胞成分と第二の制御を準備します。 </li><li>五日間37℃/ 5％CO 2でアルミホイルとインキュベートし、プレートをカバーしています。 </li><li>暗闇の中で、5 mLの丸底ポリスチレンチューブにピペッティングし、場所によって、各ウェルから細胞を収集します。 4°C、吸引メディアで5分間、500 xgで遠心し、ステップ4から洗浄バッファー300μL冷たいFACSに再懸濁します。最初の3×10 4 CFSE +細胞クエスト·ソフトウェアとヒストグラムで標的細胞を表すライブリンパ球ゲートからのイベントを分析します。 </li></ol> 6。代表的な結果 5日間の時間カップリングを介し、フローサイトメトリー疑似カラードットプロットの例RSE監視iTregの差別化がFoxP3のとCD25の共発現の相対に基づいて、CTLA-4とCD45RAは、 図2で見ることができます。 図3のヒストグラムはiTregs（CD25 こんにちは CD45RA - CD127 -/LOW細胞 ）がソートされている成功した抑制アッセイを示しています。規制/抑制能力を獲得した5日間の培養物からのサブセットのみですが、図4は、Tregの誘導を示しています。ナイーブT細胞プール（上パネル）およびメモリーT細胞プール（下パネル）から、標準iTreg培地中で5日間培養した後。初期の細胞のCFSE染色はどちらナイーブ（右上パネル）やメモリーT細胞（右下のパネル）だけ細胞分裂のいくつかのラウンド後にiTregs（最高Foxp3を発現する細胞）に分化することを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 図1実験手順の概略図。 PBMCをART細胞- + CD25 CD4の磁気負の選択の前に勾配遠心分離を介してヒト末梢血から分離電子。文化の中で五から六日後、細胞は、FACSを受け、抑制活性を測定するために異種のCFSE標識した標的細胞と共培養されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 図2精製ヒト初代CD4 + CD25 - T細胞は培地をiTregで培養されています。細胞のアリコートは、CD45RAは、Foxp3、CTLA-4とCD25マーカーの進行状況を監視するためだけに分離（0日）後1日目、3、細胞培養の5で収集されます。 iTregプロファイルは、CD45RAに対応する-は、Foxp3 こんにちは 、CTLA-4 HiとCD25 ハイ （イングラフウィンドウで強調表示されている）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 図3精製CD4 + CFSEラbeled細胞（1×10 5 /ウェル）をソートナイーブ、メモリーまたはiTreg細胞（3×10 4 /ウェル）の存在下で抑制インスペクタビーズをTreg細胞で培養されています。 5日後、細胞を採取し、染色した細胞のCFSEプロファイルはフローサイトメトリーによって分析されます。 iTreg細胞の存在は完全にCD4細胞の増殖+ T細胞を消失させる。数字が除算を受けたCFSEで標識した細胞の割合を示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 図は4つの精製したヒト初代ナイーブ（CD4 + CD25 - CD45RA +）とメモリ（CD4 + CD25 - CD45RO +）T細胞は、培地をiTregにおけるCFSE培養で染色されています。 5日後、細胞を表現型と細胞分裂率が推定されている。 図2に示すように、両方のサブセットに区別iTregサブセットはに対応していCD45RA - CD25 こんにちは FoxP3のHiとCTLA-4 のHi（後者の二つ示されていません）。比較CFSE染色プロファイルは、5日間の培養中で最も増殖細胞としてiTregs（ここでは最高に発現FoxP3のT細胞など）を識別します。

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	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-expanded,+islet-specific+CD4++CD25++CD62L++regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice.">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25++regulatory+T+cells.">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li><li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4(+)CD25(+)+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality.">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li><li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP3:+of+mice+and+men.">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li><li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+regulatory+cell+therapy:+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning.">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4+CD25++T+regulatory+cells+in+humans.">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li><li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid.">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li><li>McHugh, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling.">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

Tregの転送が自己免疫移植片拒絶反応および他の免疫または炎症媒介性疾患との闘いで膨大な治療可能性を秘めていますが、その効率的な生成と安定した保守のための方法はまだ開発されていない。ヒトT細胞を循環させる唯一の百分の1から5は、Tregsのであるので、その制御の拡大と分化は、クリニックにTregの実装の主要な抑止力としては、この不足を克服しています。我々はTGN1412試験13...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td>軸シールド</td><td> 1114547 </td><td>室温で保つ</td></tr><tr><td>冷蔵ベンチトップ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td>明るいライン血球</td><td> Hausser科学</td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySepヒトCD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep人間の記憶CD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySepヒトナイーブCD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td>ビッグイージーEasySepマグネット</td><td>セル技術を幹</td><td> 18001 </td><td>シルバー</td></tr><tr><td> 5 mLの丸底ポリスチレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mLのポリプロピレン遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 mLのポリプロピレン丸底チューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mLのポリプロピレン遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト抗CD3抗体</td><td>バイオXセル</td><td> BE0001-2 </td><td>クローン：OKT3 </td></tr><tr><td> 24ウェル細胞ポリスチレン培養プレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル丸底組織培養プレート</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン-IおよびHEPES緩衝液を含むRPMI1640 </td><td>ギブコ</td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>ギブコ</td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-β1 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> MPバイオメディカル株式会社</td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD25-PE </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-091-024 </td><td>クローン：4E3 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD45RA-PE-Cy5を</td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 15-0458-42 </td><td>クローン：HI100 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD127-APC </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-094-890 </td><td>クローン：MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNアーゼII </td><td> MPバイオメディカル株式会社</td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFloフローサイトメーター</td><td>ベックマン·コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJoソフトウェア</td><td>ツリースター株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルクエストProソフトウェア</td><td> BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新生仔ウシ血清</td><td>ギブコ</td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td>ギブコ</td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE細胞増殖キット</td><td>インビトロジェン</td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg細胞の抑制インスペクタビーズ</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40μmのナイロン細胞株えー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

免疫CD4 +制御性T細胞（Tregの）の開発と保守はで、人体の自己と共生抗原の膨大な量の免疫学的恒常性のままにするために必要な末梢性寛容に貢献しています。 Tregsのと炎症、従来のT細胞のバランスの乱れは、免疫病理や癌になる可能性があります。 Tregの治療注入大腸炎1、I型糖尿病2、関節リウマチ、移植片対宿主病は、ヒト対マウスTregの生物学5の4いくつかの根本的な違いのマウスモデルに有効であることが示されているが、これまでの臨床使用を排除しています。十分な数、純度、安定性と治療Tregのホーミング特異性の欠如は、彼らのex vivoでの拡張6のための条件を最適化する上で人間のTregの開発のダイナミックなプラットフォームを必要とした。 ここでは、Din vitroでの細胞培養と蛍光活性化末梢血単核細胞、CD4の磁気選択+ T細胞の分離、4つの段階に分けることができ、単一のヒト末梢血ドナーから誘導Tregsの（iTregs）の分化方法を傍接させるT細胞サブセットの細胞選別（FACS）。 Tregの署名の転写因子のフォークヘッドボックスのP3（Foxp3は）人間の7の活性化誘導転写因子および他のユニークなマーカーであるため存在しますが、マーカーの組み合わせパネルは抑制活性を有するT細胞を同定するために使用する必要があります。文化の中で6日後、私たちのシステムの細胞がナイーブT細胞は、CD25とCD45RAのそれらの相対的発現に基づいてメモリーT細胞またはiTregsに画定することができます。メモリなどとナイーブT細胞はCD45RA +およびCD45RO +サブセットができますbに初期のT細胞集団の事前選別は、別の報告偏光の要件と塑性挙動8を持っているeは、これらの不一致を調べるために使用されます。他者との一貫性のある、私たちのCD25 こんにちは CD45RA - FoxP3の9のiTregs急行高レベル、GITRおよびCTLA-4 11およびCD127 12の低レベル。各集団のFACSに続いて、得られた細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識したT細胞自家の増殖を抑制するための相対的能力を評価し、抑制アッセイで使用することができます。

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

24.0K ビュー.  University of Kentucky. 我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。

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A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

がん研究

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

免疫・感染学

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

<meta charset="utf8"></head><body>免疫制御療法のためのヒトCAR制御細胞の工学と拡大

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable hematological cancers. These successes have spurred interest in adapting the CAR platform to a small yet pivotal subset of CD4+ T cells primarily responsible for regulating and inhibiting the immune response, regulatory T cells (Tregs). The ability to redirect Tregs&#39; immunosuppressive activity to any extracellular target has enormous implications for creating cell therapies for autoimmune disease, organ transplant rejection, and graft-versus-host disease. Here, we describe in detail methodologies for bona fide Treg isolation from human peripheral blood, genetic modification of human Tregs utilizing either lentivirus or CRISPR/Cas9-aided knock-in using adeno-associated virus-mediated homologous directed repair (HDR) template delivery, and ex vivo expansion of stable human CAR Tregs. Lastly, we describe the assessment of human CAR Treg phenotypic stability and in vitro suppressive function, which provides insights into how the human CAR Tregs will behave in preclinical and clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

This protocol provides a streamlined workflow to generate and test human chimeric antigen receptor regulatory T cells (CAR Tregs).

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

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