本研究では、博士イアングッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給された。

1。細胞株の生成：pMEP4トランスフェクション/式<ol><li> pMEP4発現ベクターで細胞をトランスフェクトすると、すべてのモックトランスフェクトした細胞がオフに殺されたまで、ハイグロマイシンB / mlの（Roche）を100μgのを選択します。特定のクローンを単離する必要はありませんので、プラスミドpMEP4はエピソーム維持されます。 </li><li> pMEP4ベクターを含む細胞は、16時間、10μMCDCL 2で処理することにより誘導することができる。の発現と誘導性は細胞株の増幅の前に小さな規模で確認されるべきである。プロテインGのドメインは、ほとんどすべての種からの抗体に結合するTAP-tagタンパク質は容易に検出することができます。大規模な精製の ​​ための細胞の一般的に10コンフルエント175cm 2のフラスコが必要となります。これは約2 X10 8を発現する細胞に相当します。 </li></ol> 2。細胞ライセートの調製<ol><li> PBSに細胞をこすり、単一の50 mlチューブに結合します。 1200倍GFを回転させるまたは5分（これは洗濯後約1.5 mlに減少して起動するにはパックされた細胞は2-3 mlのになる必要があります）。 </li><li>細胞を氷冷PBS（50 MLS各時間）で3回洗浄します。 </li><li> 5 mlの溶解バッファーで細胞を溶解液（50mM Tris-HCl（pH7.5）で、125 mM塩化ナトリウム、5％グリセロール、0.2％NP-40、1.5mMのMgCl 2、25mMのNaFを、1mMののNa 3 VO 4及びプロテアーゼ阻害剤。）注：フッ化ナトリウムは、Na ​​3 VO 4、およびプロテアーゼ阻害剤は、新鮮に追加する必要があります。氷上で5分間出る前に10回ピペッティングします。氷上で5分間氷上で再び出発前に鈍針を用いて注射器を上下に5〜10倍。 syringingを繰り返して、氷上でさらに5分間放置。 </li><li> （液体N 2 /またはドライアイスとエタノール）ライセートを二回凍結融解。サンプルは4℃以上に到達することはできません注：処理する時間があるまでは、-80°Cでこのサンプルを保存することができます。 </li><li> 1.5 mlチューブに小分けサンプルとunlysed細胞とDを削除遠心分離（4℃、10分°C、16,000 X g）でebris。 </li><li>上清を回収し、15mlファルコンチューブに結合し、（オプションで）タンパク質収量の定量化のために20μlのサンプルを取る前に0.45μmフィルターを通過します。その後の分析（サンプル1）さらに50μlのアリコートを削除します。 </li></ol> 3。ウサギIgG-アガロースに結合する （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>静かに瓶を渦巻くことでウサギIgG-アガロース溶液（Sigma-Aldrich社）を懸濁します。 IgGアガロース（カット1ミリリットルピペットチップを使用して）380μlを取り、1分間の遠心分離により出荷/保存液を除去します。明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解バッファーにアガロース三回（4°C）を洗浄します。アガロースの最終収率はパックされたビーズの約250μlのでなければなりません。 </li><li> 2.6（15mlファルコン浴槽内から消去細胞ライセートを追加します。e）は4℃で3時間洗浄したウサギ抗IgGアガロースとインキュベート（または一晩）℃まで回転ミキサーを使用します。 </li><li> 4°Cで5分間アガロースビーズの回転を停止し、その後の分析（サンプル2）の上清を除去します。注：タンパク質タグ付けされ、TAPは現在、ビーズに関連付ける必要があります。 </li></ol> 4。 TEVプロテアーゼ切断 （注：特に断りのない限り、すべてのスピンが、1分間4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>チルド溶解緩衝液中でウサギIgGアガロースビーズを3回洗浄（4℃）（注：溶解バッファーは、プロテアーゼ阻害剤を含むべきではありません）明確にするために遠心分離を使用します。ケアは洗浄ステップ中にビーズを削除したり、紛失しないように注意する必要があります。 </li><li>明確にするために遠心分離を用いたTEVプロテアーゼ切断緩衝液（10mMトリス-HCl（pH 7.5）を、100mMのNaCl、および0.2％NP-40）でビーズをさらに2回洗浄します。最後の洗浄の後を慎重にすべてのliを削除するビーズから一口分。 </li><li> TEVプロテアーゼ切断ミックスを調製する。各サンプルについては、467.5μlのH 2 O、25μlの20倍TEVバッファー（Invitrogen）を、5μlの0.1M DTTおよび2.5μL（25 U）TEVプロテアーゼ（Invitrogen）を含む。パックされたビーズの各サンプルにこのTEV切断ミックス500μlのを追加し、1.7ミリリットルプレ給油管（コスター社）にミックス全体を転送します。インキュベーションの前にその後の分析（サンプル3）30μlのアリコートを削除します。 </li><li> 4℃で一晩TEVプロテアーゼ反応をインキュベート°C回転ミキサーを使用します。短いインキュベーション時間は経験的に決定されるべきであるbaitタンパク質とTEVプロテアーゼ切断部位が最小限のインキュベーション時間のアクセシビリティの性質に応じて使用することができないことに注意してください。 </li></ol> 5。固定化ストレプトアビジンビーズをプラスULTRALINKに結合 （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） </P&gt; <ol><li> 1200倍G（4°C）で5分間ウサギIgGアガロースビーズを含むTEV切断反応を遠心します。分析のために明らかにし、上清の20μlのアリコートを取り外します（サンプル4） </li><li>新鮮1.5ミリリットルプレ給油管（コスター社）に、残りの上清（約480μl）を転送し、氷上でこのままにしておきます。この上清を捨ててはいけない - これはあなたのTEV切断されたbaitタンパク質と関連するすべての結合タンパク質を含んでいます。 </li><li>残りのウサギIgGアガロースビーズを再懸濁してチルドの溶解緩衝液を500μl（2.3節）を追加します。上清を除去し、ステップ5.2からそれと組み合わせる前に、ビーズを明確にするために、この混合物を遠心分離します。 （それは現在のサンプル〜980μlを含む必要があります）氷の上で、このチューブのままにしておきます。 </li><li>その後の分析のためにウサギIgGアガロースビーズ（サンプル5）を保持します。注：SDS-PAGEゲル（またはウェスタンブロット）でこのサンプルを実行する場合、それが原因で、重鎖および軽IgGの存在の背景の多くを与えるチェーン。 </li><li>一方、優しくULTRALINKボトルを渦巻くことでストレプトアビジンプラスアガロースビーズ（Pierce）を固定化に再懸濁します。無給油1.5 mlのチューブに、サンプルあたりのストレプトアビジンビーズのアリコートを70μlのエンドカットで200μlのピペットチップを使用して、遠心分離によって出荷/保存液を除去します。注：これらのビーズは非常に小さいので、 &quot;アヒルのくちばし&quot;や平坦である/ナローエンドのヒントは、洗濯中にビーズの損失を最小限にするために使用することができます。 </li><li>ストレプトアビジンビーズを明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解用緩衝液で3回（4°C）を洗浄します。これは、チューブあたりパックビーズの約45から50μlを残す必要があります。 </li><li> °C回転ミキサーを用いて4℃で3時間（または一晩）洗浄し、ストレプトアビジンビーズとインキュベートを含むチューブにTEVプロテアーゼ切断上清（すなわち、ステップ5.3からのサンプル980μl）を転送します。 </li><li> 4℃で5分間ストレプトアビジンビーズの回転を停止し、（その後の分析のために上清を除去サムPLE 6）。ストレプトアビジンビーズを明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解用緩衝液で3回（4°C）を洗浄します。最終洗浄後、慎重に残りのすべての洗浄バッファーを削除します。 </li></ol> 6。ストレプトアビジン結合ペプチドとbaitタンパク質のビオチン溶出 （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>ビオチン（1 mMのD-ビオチン）、回転ミキサーを使用して3時間（または一晩）を4℃でインキュベートした：PBS 500μLを加えることにより、ストレプトアビジンビーズからのHisタグ融合タンパク質を溶出します。 </li><li> 4℃で5分間ストレプトアビジンビーズの回転を停止し、1.5ミリリットルプレ給油管（注に上清を除去：これはあなたの最終的なサンプル/溶出（サンプル7）です。 </li><li>残りのストレプトアビジンビーズをPBS、回転ミキサーを使用して2-3時間（または一晩）を4℃でインキュベートする：別の500μlのビオチンを追加します。 </li><li>投稿泥炭は、ステップ6.2および2溶出（サンプル7）を組み合わせる。この最後の溶出は-80℃で保存することができます</li><li> 、ビオチン溶出の効率性を評価し、残りのストレプトアビジンビーズを凍結し、SDSサンプルバッファー（サンプル8）（推奨：フィッシャーからLaneMarker 5倍削減するサンプル緩衝液）の後で沸騰します。 </li></ol> 7。タンパク質濃度<ol><li>最後の溶出液（サンプル7）が低いため、タンパク質濃度と相対的に高いボリュームの分析の前に集中する必要があります。これは、低分子量（&lt;5 kDa）のVivaspinスピンカラム（Vivascience）を使用して達成することができます。未満100μlに音量を下げ集中することを目指しています。この最後のサンプルは、煮沸し、タンパク質試料バッファー（推奨：フィッシャーからLaneMarker 5倍削減するサンプル·バッファ）に格納することができます。 </li></ol> 8。分析<ol><li>サンプル1-8プルダウンの効率を決定するためにウェスタンブロットで分析することができます。注：する最も二次抗体融合タンパク質のプロテインGドメインと交差反応するが、これは、TEVプロテアーゼ切断後に削除されます。 </li><li>サンプル7は、1Dまたは2D SDS-PAGEで分析することができます。染色は銀またはクマシー（：SilverQuest銀染色およびInvitrogenからコロイダルブルークマシー染色キット推奨）を使用して実行することができます。タンパク質同定は質量分析を用いて行うことができる。 </li></ol> 9。代表的な結果 TAPタグ付けeIF4Eの結合パートナーを識別するには、このプロトコルからの最終的な溶出（サンプル7）の1D SDS-PAGE分析の例を図2に記載されています。この代表的なゲルは、セル内の他のタンパク質とeIF4E相互作用の複雑で豊かな自然を反映しています。また、唯一のTAPタグを発現する細胞株から生成され、図2に示すように、陰性対照との比較は、プルダウン餌このeIF4Eの特異性を示しています。このインスタンス内で濃縮された最終的な溶出の15％（サンプル7）はInvitrogenからSilverquest銀染色キットを用いて染色される前に、市販のプレキャスト勾配ゲルを使用して、1D SDS-PAGEにより分析した。 一般的に残りの濃縮された最終的な溶出の百分の50から85（サンプル7）染色コロイドクマシー（Invitrogen社製）で分析されています。全体の車線からのサンプル（ゲルスライス/バンド）を質量分析によって抽出されたと分析した。 プルダウンeIF4Eに同定されたタンパク質は、非特異的結合パートナーを識別するために、ネガティブコントロールから結合パートナーに対して、ろ過した。 TAPタグ付けeIF4Eのこのプロセスを用いて同定し、最終的なタンパク質は、この手法を用いて同定し、通常のタンパク質の代表である、図2に見ることができます。さらに、eIF3サブユニットの数も（データは示さず）が同定された。 <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。の模式図タンデムアフィニティー精製の ​​手順は6段階のタンデムアフィニティー精製（TAP）プロトコルは、細胞株の生成、細胞溶解、ウサギIgGアガロース免疫沈降、TEVプロテアーゼ切断、ストレプトアビジンビーズアフィニティ精製し、最後にビオチン溶出が含まれます。 <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。マウスeIF4Eタンパク質のタンデムアフィニティー精製、Nの対話パートナー末端タグ付きのeIF4Eのタップが接続されたプロトコルを使用して、真核HEK293細胞から精製した。最後の溶出（サンプル7）の20％の画分は、プレキャスト4-12％勾配ゲル（TAP-eIF4Eレーン）をSDS-PAGEにより分析した。同等の分析が単独でタグ（TAPレーン）を行った。タンパク質は銀染色を用いて同定した。その後、同じ試料の質量分析法によって同定されたタンパク質は、このゲル上で強調表示されます。 略語：eIF4G、真核生物の翻訳開始F俳優4ガンマ、PABP、ポリA結合タンパク質、eIF4A：真核生物翻訳開始因子4α、SBP-eIF4e、真核生物翻訳開始因子4E結合、真核生物翻訳開始因子4Eに融合し、4EBPsストレプトアビジン結合ペプチドを含む、残りのTAPのbaitタンパク質タンパク質、eIF4eNiF1l真核生物翻訳開始因子4E核インポート因子1、SBP、TEV融合していないTAPのペプチドから残りのストレプトアビジン結合ペプチド。

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここに示すTAPタギング技術は、真核細胞内でベイトタンパク質の結合パートナーを単離するための高度に特異的かつ厳格な方法を示しています。このアプローチは、細胞とウイルス両方のタンパク質に適用することができます。我々の知る限り、このような手法は翻訳開始因子eIF4Eに適用されたのは今回が初めてです。このテクニックを使用して既知のeIF4E結合タンパク質のeIF4Gと4EBPsの同定は、このようなアプローチの有効性を確認します。さらに、eIF4F複合体の残りのコンポーネントの識別、すなわちeIF4Aと、PABPは、間接的な相互作用および第三複合体が精製プロセス中にそのまま残っていることを確認します。標準的なeIF4e結合タンパク質の複数のアイソフォームの同定にも明らかであった。これらは、図2で詳細に説明されています。 アプローチの限界に関しては、一定の注意が選択肢に関しては注意が必要ですbaitタンパク質およびN末端またはC末端タグtagを配置するか否かを判定する。それは機能的アッセイを実施またはタグ誘導体の機能であることを確認する前に、フルスケールの精製に顕微鏡により融合タンパク質の局在を調べることをお勧めかもしれません。内在性膜や核タンパク質は必ずしも溶解ステップで説明されて相対的に中性洗剤を条件によって解放されない場合があります。すべての免疫沈降と同様のプルダウンアッセイと同様に、変更は溶解の効率を高めるために溶解バッファー中で自然と洗剤の濃度に作ることができる。溶解および洗浄バッファーのイオン濃度はまた、精製のストリンジェンシーを増加または減少するように変更されることがあります。それは、標準的な温和な条件（上記）で初期精製を行うことも可能ですが、その後に続いて増加するイオンの消費で洗浄することができます4月5日のアリコートにストレプトアビジンビーズ（セクション5.8）、分割ditions。これにより、ユーザーは、非特定の相互作用するタンパク質を除去する最適な条件を識別するために有効にすることができます。全体のプロセスは、相互作用パートナーが知られており、それらの有無だけで、その後のウェスタンブロットによって決定される一過性トランスフェクションを使用して実行することができます。このケースでは、発現プラスミド8μgのトランスフェクションした細胞の2 100センチメートル2皿ずつお勧めします。既知の結合パートナーと相互作用するTAP-融合タンパク質の変異体の誘導体の能力を調べるときにこの変更されたプロシージャは、特定の使用である。 テクニックは許容可能な結果を​​生成するために失敗した銀染色SDS-PAGEゲル（またはウェスタンブロットによる抗体が使用可能な場合）に8を介してサンプル1を分析することで、トラブルシューティングの優れた方法です。それぞれの親和性に基づく降水量と特定の溶出の効率が、この体系的なサンプリング手法を用いて分析することができます。サンプル八から一はoptim中に撮影されるべきそれぞれの新しい餌のためのプロトコルの化。 TAPタグ付け技術は、GSTのような他のアプローチはプルダウンなどの二重アフィニティー精製および特定の溶出ステップ（TEV切断部位とビオチン溶出）で維持する特異性と厳しさを提供して酵母ツーハイブリッドアッセイをに強力かつ堅牢な代替手段を提供精製工程を通して高いレベル。批判的にこの手法は、任意のタンパク質に適用することができるので、目的のタンパク質ターゲットの結合パートナーを同定するための優れた方法を表しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>ロシュ社</td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td>ウサギIgGアガロース</td><td>シグマ</td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEVプロテアーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>カルビオケム</td><td> 539134 </td></tr><tr><td> UltraLinkは、ストレプトアビジンプラスビーズ固定化</td><td>ピアース</td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500遠心濃縮機（5KDa） </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest銀染色キット</td><td>インビトロジェン</td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> NOVEXコロイドブルークマシー染色キット</td><td>インビトロジェン</td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ミリリットル封入管</td><td>共演者</td><td> 3207 </td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーピペットチップ</td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4から12パーセントビス - トリス勾配ゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CDCL 2 </td><td>シグマ</td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5X SDSサンプルバッファー</td><td>フィッシャー</td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

ホストとウイルスタンパク質の機能を理解する上で重要かつしばしば律速段階は、細胞またはウイルスタンパク質パートナー相互作用の識別です。酵母ツーハイブリッドシステムと同様に、組換えタンパク質および質量分析同定続く1内因性タンパク質の免疫沈降を用いたアッセイをプルダウンを含む相互作用パートナーの同定を可能にする多くのアプローチがあります。最近の研究では、相互作用するタンパク質の同定つの特定の溶出ステップで結合し、ダブルアフィニティータグ媒介精製の有用性を強調している。このアプローチでは、と呼ばれるタンデムアフィニティー精製（TAP）は、最初に酵母2,3で使用されていたが、最近哺乳動物細胞で4-8を使用するように適応されています。 概念実証として、私たちは十分に特徴付けられた真核生物の翻訳開始FACを使用してタンデムアフィニティー精製（TAP）法を確立していますTorのeIF4E 9,10。携帯翻訳因子eIF4Eはキャップ依存性翻訳開始10に関与する細胞eIF4F複合体の重要なコンポーネントです。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、ストレプトアビジン結合ペプチドは、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ切断配列で区切られています。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ切断配列8で区切られたストレプトアビジン結合ペプチドである。クローン細胞株を生成するための必要性をあきらめるために、我々はpMEP4（Invitrogen社）に基づいて、エピソームに保持するプラスミドから、TAPタグ付きベイト蛋白質の発現に依存して迅速なシステムを開発しました。このプラスミドからのタグ付きマウスeIF4Eの発現は、塩化カドミウム誘導性メタロチオネインプロモーターを用いて制御されていました。 Rへの結合を介して発現する細胞とそれに続くアフィニティ精製の溶解abbit IgGアガロース、TEVプロテアーゼ切断は、ストレプトアビジン架橋アガロースに結合して（単独TAPタグを発現する細胞株を制御する場合と比較して）、その後のビオチンの溶出は、プルダウンeIF4Eに明らかに特定の多くのタンパク質を同定した。タンパク質の同定は、1D SDS-PAGEからのバンドの切除とその後のタンデム質量分析により得られた。識別されるコンポーネントは、eIF4Gと4EBP-1の既知のeIF4E結合タンパク質が含まれています。さらに、eIF4EがコンポーネントであるeIF4F複合体の他の成分は、eIF4Aとポリ-結合タンパク質すなわち、同定された。知られている直接の結合パートナーとしてだけでなく、二次相互作用するタンパク質だけでなく、を識別する能力は、さらに、機能未知のタンパク質の特性評価では、このアプローチの有用性を強調しています。

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Biology

37.4K ビュー.  Imperial College London. タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

生化学

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

生物学

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Source: Ma, Z., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55236">Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem affinity purification &#8212; a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

Source: Ma, Z., et al. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem ...

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

要約

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この動画の章

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

2 の 1: タンパク質・タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

のタンパク質複合体の同定

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

要約

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真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

のタンパク質複合体の同定

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

2 の 1: タンパク質・タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ