我々はこのプロジェクトのために資金を提供するためのミッションConnectとGillson - Longenbaugh財団の両方に感謝したいと思います。我々はまた、彼女のDXA装置の彼女の重要なアドバイスと使用のために博士キャサリンアンブローズに感謝の意を表します。最後に、我々は、DXAの大腿骨の分析では彼女の提案のために博士香織小野、統合生物及び薬理学教室を、感謝したいと思います。

1。マウス脊髄切断モデル<ol><li>大人、男性、C57BL6マウス（約20〜25 g）は、ケタミン（200 mg / kg）をとキシラジン（10 mg / kg）の組み合わせを使用して麻酔する。すべての外科手術は無菌条件下で機関、IACUCに承認された手術室で行われます。 </li><li>一度深く麻酔、バックの毛を電気バリカンを使ってトリミングされます。剃毛背部は70％エタノールに続くヨウ素溶液との最初のスクラブです。 </li><li>最初の切開の前に、切開する背面の面積は、最初の手術後の痛みを最小限に抑えるための濃度（0.25％、&lt;1ml/kg）で局所麻酔薬（Marcaine）で浸潤されています。 </li><li>小さなはさみを使用して、小さな開口部がL2の領域付近での皮膚で作られています。この開口部はT2エリアに長手方向に延びる、はさみの同じセットで展開されます。皮膚の縁は、その後ブルドッグクランプの使用を介して離れて開催されます。 </li><li>マイクロシザー構造がその後使用されています胸椎レベル8（T8）で背側脊髄ラミナから筋肉組織をクリアに。クウとWrathall（1998）10に記載のT8を識別することができます。簡単に言えば、T13はその背棘突起によって識別することができます。 ＃5デュモンのピンセットを使用して、最後の肋骨は触知/識別とT8に戻ってカウントすることができます。一旦クリアされると、骨RongeursはT8で背側椎弓切除を実行するために使用されます。 </li><li>完全脊髄切断の病変：いったん脊髄を滅菌マイクロシザーの追加セットが手術用顕微鏡下で脊髄の長軸に垂直な平面で脊髄を切断するために使用される、T8で公開されている。我々は穏やかに病変の完全性を確認するために脊髄の一方の極を持ち上げるために＃5デュモンの鉗子を使用してください。 </li><li>脊髄切断に続いて、滅菌生理食塩水に浸した滅菌gelfoamの小片、（0.9％）を慎重に止血を促進するために病変空洞内に配置されます。 </li><li> gelfoamの追加部分は、露出したスピンの上に配置されアルコード。皮膚を無菌、ステンレス製の外科用ステープルで閉じられます。被験者は、その後、自分のホームケージに戻した寝具の材料の吸引を防止するためにペーパータオルの上に置き、約12時間の期間のための加熱パッドで暖めています。被験者はまた、早期に回復中にケージの床の上にハイドロパック（ClearH2O）と食品ペレットと提供されています。負傷した被験者は自分のホームケージでの食品/水は、一度麻酔から回復にアクセスすることができます。 </li><li>すべての負傷者の被験者は、試験期間（40日）のためのクレーデの手動方法の変更を使用して1日2回のマニュアル膀胱の避難を（約12時間間隔で）受け取る。 </li><li>負傷したマウスは、の期間のための外科手術後の痛みを制御するためにも、アヘンのブプレノルフィンの水和を維持するために三日間のための0.9％生理食塩水（0.5 CC）の毎日二度腹腔内注射で提供される、1日2回注射（0.05 mg / kg体重）です。 5日間。動物はサインoを示す場合痛みの兆候（処理不自由、背を丸め身長、新郎への障害、発声が）解決するまで、最初の5日間の期間の後にfの痛みは、彼らが毎日追加ブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を受け取ることになります。 </li></ol> 2。脊髄- transectedマウスの同一コホートでIVISルミナXRを使用して、骨密度の長期的評価<ol><li> 10日目後SCIで始まり、40日まで10日間の間隔で継続し、我々は、生活の中で右と左大腿骨と脛骨を評価した麻酔の被験者（切除SCIと無傷年齢をマッチさせた対照）。 </li><li>スキャンの日に、被験者はキャ​​リパーIVISルミナXRが収容される部屋に機関のビバリウムの領域から彼らのホームケージに移した。すべての被験者は、以前にSCIの配信で使用したのと同じケタミン/キシラジンカクテルを使用して麻酔する。このカクテルは、1〜1.5時間の期間のために麻酔の状態を保証します。scannの期間中、十分なここに示す操作手順。 </li><li>調査官は、ルミナXRのデバイスを初期化して内部カメラが正常に動作温度（-90 ° C）（〜10分）に到達することができます。 </li><li>かつて麻酔、被験者（切除または制御）が静かにルミナXR内で動物のプラットフォーム上に配置されます。高倍率のレンズは、大腿骨と脛骨の領域（高倍率レンズとビュー2.4X2.4cmのフィールド）の両方にフォーカスを可能にするデバイスに挿入されます。対象が不適切に視野の外に配置されている場合、ドアが開かれ、左または右後肢を中心にされるまで（後肢の適切な配置のための図2aを参照）、再配置対象。 </li><li>一度適切に配置、X線の機能を実行することができる。 動物に適したエネルギーのドロップダウンリストから選択します（リビング主題、35 Kv値100uA、X線フィルタ処理） </li><li>動物が正しい位置にあれば、チェックイン時に、マーキングX線によるX線機能を有効にするコントロールパネルは。X線画像を取得 。全体の大腿骨と脛骨が（図2bを参照）表示されることを確認します。生の画像データは、自動的にハードドライブに保存されます。代表的。TIFFファイルも保存されます。マウスは、そのホームケージに戻され、捜査官の監視の下に回復するために許可されています。プロセスは、次のマウスを使って繰り返されます。 注：リビングイメージのソフトウェアは、デフォルトで変換されたX線画像が表示されます。生のX線画像を表示するには、修正/フィルタリングツールのX線吸収の横にチェックマークを外します。 X線のデータは吸収のために修正されているときには、測定のROIの信号強度を比較することによって相対的な骨密度を評価することができます。 ROIの強度が増加する組織の密度が増加する。 </li></ol> 3。 IVIS X線スキャンの画像解析<ol><li>リビングイメージのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。 </li><li>クリックして、X線像をロードする<st栄&gt; [参照]ボタン。表示されるダイアログボックスで、関心のフォルダを選択し、[OK]をクリックします。リビングイメージのブラウザでは、選択したユーザーIDとともにデータ、ラベル情報、およびカメラの設定情報が表示されます。データを開くには、以下のいずれかの操作を行います：データ行をダブルクリックし、データの名前を右クリックし、ショートカットメニューの[ 読み込み]を選択し、データの行を選択して、Load をクリックするか、サムネイル ​​をダブルクリックします。画像とツールパレットが表示されます。開いているデータは、ブラウザの緑色で強調表示されます。 </li><li>ツールパレットで、ROIツールをクリックしてください。 ROIツールで、Typeドロップダウンリストから選択測定ROI。この実験で用いる3のROIをロードするには、 正方形のアイコンをクリックして、3乗をロードする。 </li><li>定規を使用して、大腿骨の長さを測定する。総大腿骨の長さの1 / 8 番目になる正方形の二つの長さを調整します。。総大腿骨の長さを1/24thされるこれら2つの四角形の幅を調整します。あなたの定規、測定1月8日大腿骨の近位端からの距離の目 、そしてそれは大腿骨の中央に配置されるように正方形を位置づけると。それは大腿骨の遠位端（図3）から総大腿骨の長さの4分の1にあるように、2番目の四角を位置づける。これらのROIのは、近位および遠位の両方大腿骨領域を測定するために使用することができます。 </li><li>定規を用いて、脛骨の長さを測定する。合計脛骨の長さの1 / 8 番目であることが第三平方の長さを調整します。合計脛骨長さの1 / 30日に幅を調整します。正方形を位置づけるように中心に、1 / 8 番目の脛骨の近位端（図3参照）から脛骨の距離の合計の長されている。 </li><li> 測定アイコン（鉛筆と定規）をクリックしてください。 ROIの強度測定は、X線画像に表示され、ROIの測定値のテーブルが表示されます。このテーブルtをエクスポートする。csvファイルとして任意の場所をO。これは、Excelを使用してテーブルを開くことができます。 </li><li>保存した画像のすべてでこれを繰り返します。 </li><li>あるExcelシート上のすべてのデータを統合する。統計的有意性は、Microsoft ExcelまたはSigmaPlotの11.0ソフトウェア（SYSTATのソフトウェア）のいずれかを使用して学生のt -テストにより決定した。 </li></ol> 4。骨密度の事後分析： <ol><li> IVISルミナXR内で最終的な縦のX線スキャンの買収に続いて、マウスはその後Beuthanasia（75mgのペントバルビタール/ kg）で深く麻酔する。一度深い麻酔が達成されている、マウスtranscardially氷冷リン酸緩衝血を抜くためにheparain（40 mg /リットル）と生理食塩水で灌流されています。 </li><li>いったん放血、消費税の両方大腿骨。これは密度の測定値11を影響を与えることが示されているために、できるだけ多くの軟組織を除去するために特別な注意を払ってください。で水に浸したガーゼや店舗で大腿骨を包みます- 20Cは、それらを分析する準備が整うまで。 </li></ol> 5。 Hologic QDR 4000骨密度測定装置を用いてDXA分析<ol><li>融解のガーゼに浸して大腿骨と骨密度測定装置のスイートへの転送。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って装置のキャリブレーション、BMCとBMD値が許容範囲内であることを確認してください。 </li><li>マシンの真鍮のコリメータを配置。これにより、ユーザーは特定のターゲットに集中するX線ビームの大きさと角度を制限することができます。 </li><li>沈める水（左顆、ベッドに大腿骨と平行）、とだけレーザーの右側に位置してで満たされたペトリ皿に解凍した大腿骨。 </li><li>スキャンしようとしている大腿骨のための伝記 （動物の識別情報、治療、等を含むわかりやすいタイトルを）入力します。 </li><li>選択メニューからスキャンを入力し、[regionA高解像度を選択します。あなたのスキャンパラメータを示している：0.01インチ行間隔と0.00499インチ点の分解能で、2 × 0.7489インチの領域をスキャンする。 注意：これは進行中にスキャンを監視する。 X線ビームラスターはサンプルをスキャンするように、完全に骨のサ​​ンプルをカバーするためにチャンバ内に十分な水があることを確認するために監視する。 </li><li>分析の選択]メニューの下に分析入力してください。 ROIとして全体の大腿骨を強調するためにプロンプ​​トに従います。レポートページは、計算されたBMC（グラム）とBMD（GMS / cm 2）をしてくるだろう。 </li><li>残りの大腿骨を分析するためにこれらのステップを繰り返します。 </li><li>あるExcelシート上にすべてのデータを統合し、（t -検定）統計分析を行います。 </li></ol> 6。代表的な結果： ナイーブなマウスと比較して、脊髄損傷後のマウスの脛骨と大腿骨の相対的な骨密度の低下は、上記の方法を用いて検出可能である。後の骨密度の検出可能な大幅な低下を起こすことがあります40日で最大15％の骨密度の低下（P &lt;0.0005、図4）とわずか10日間（12％、P &lt;0.0005）、。大腿骨の骨密度の低下は、40日後の傷害（7％減少、P &lt;0.05、図5）で観察された。これらの結果は、脊髄損傷後の骨密度変化の長期的観察のための非侵襲的なX線イメージングを使用するための証拠を提供する。 現在利用可能なものへのこの方法の有効性を比較するために、我々は40日DXAイメージングを使用して負傷した後、これらのマウスの摘出した大腿骨を分析した。データ出力の表現は、図6で見ることができます。我々は（12％減少、P &lt;0.05、図7）ナイーブと比較すると骨ミネラル含量の著しい損失がSCIのマウスではないことがわかった。骨密度は有意な変化が、同様の傾向（図8）に従うでしたしませんでした。これらの結果は、文学に見られるものと類似しています。ピカードらはBMCで13.5％減少した（P &lt;0.001）が、有意なDECRを観察BMD（ピカード2008）に容易になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig1.jpg" /> 図1実験のタイムライン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig2.jpg" /> 図2左後肢の代表者向き：。）写真とb）のX線。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig3.jpg" /> 図3。近位大腿骨と脛骨の地域内でのROIの大きさと向き。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig4.jpg" /> 年齢をマッチさせたnaives（N = 5）に比べて30〜40日負傷後の脛骨近位部10、20、（N = 5）におけるSCI後の図4。骨密度の低下。エラーバーはSEMを表す、** P &lt;0.005、*** P &lt;0.0005。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig5.jpg" /> <st年齢をマッチさせたnaives（N = 5）に比べて30〜40日負傷後の近位大腿骨10のSCI後の栄&gt;図5。骨密度の損失、20、（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P &lt;0.05。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig6.jpg" /> 図6。10、20、30、40日負傷後の遠位大腿骨におけるSCI後の骨密度の低下（N = 5）年齢をマッチさナイーブなコントロールと比較して（n = 5）の。エラーバーはSEMを表す。* P &lt;0.01〜0.05、** P &lt;0.001〜0.01、*** P &lt;0.0001から0.001; **** P &lt;0.0001。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig7.jpg" /> 図7。BMCとBMDの出力を示すDXAデータの代表的なイメージ。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig8.jpg" /> 図8。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨塩量の分析（グラム）40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P &lt;0.05。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig9.jpg" /> 図9。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨密度の分析（mg / cm 2）を40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。有意な差は、エラーバーはSEMを示す。

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利害の衝突は宣言されません。

この研究では、キャリパーIVISルミナXRイメージングシステムを用いて、マウスのシングルコホート内で、縦方向に（脛骨と大腿骨）個々の骨の中で密度の変化を評価するための新たな、非侵襲的方法を提示。 SCIは、年齢をマッチさせた、無傷、対照マウスと比較して40日の検定の期間にわたって脊髄- transectedマウスの単一のコホート内研究大腿骨と脛骨の両方で骨密度の減少を作り出した。大腿骨の我々の結果は、キャリパーインスツルメンツIVISルミナXRのアプリケーションは、骨量の減少にSCIの長期的かつ進歩的な影響を評価するために敏感な測定ツールとなり得ることを示唆し、DXAを使用して、事後、確認された。 このシステムを用いて研究者に一つの潜在的な利点は、長手方向にSCIを以下の動物の後肢の骨の病理学的変化の開発を追跡する機能です。長期間にわたって、単一のコホートを評価する能力は、STが提供さの点で研究者に栄の利点：動物の購入や長期ケアに関連付けられている1）コスト。代わりに、時間依存性の変化を評価するために、特定の時点で屠殺する必要のある動物の多数を必要とする研究から、これらの病理学的成果は、同じ期間、2以上の同一コホート内で追跡することができる）の変動：に加えて、コントロールコホートとの比較は、負傷した被験者の単一のコホート内で生成された成果を評価し、研究の範囲全体に同じ動物のための時間のポイントの間で比較することができます。もう一度、両方のイントラ動物変動だけでなく、大規模の必要性を減らす実験対象のコホート。 キャリパーIVISルミナXRは、SCI誘発性骨粗しょう症の開発に関する重要な長手方向の情報をご提供している間、考慮すべき制限があります：1）このプラットフォームは、私たちは、高分解能X線datを生成することができましたしながらSCIの後のマウスの後肢の骨で、そのユーティリティは、マウスなどの小型げっ歯類に限定される場合があります。ルミナXR内で許容される最大の主題の高さは2.8 cmです。その高さは上記のものは正常にルミナXRのX線成分を用いて画像化することができます。私たちの手で、これは200〜250グラムの重量でラットを研究する我々の能力を妨げている。それは、この重量の範囲や、ハムスターや砂ネズミのような他のげっ歯類の下に画像のラットへの可能性かもしれませんが、これはPIによる追加テストが必要になります。 2）ジョイント向き。それは、調査員が慎重にイメージングセッション間の正常な比較を可能にする容易に再現可能な方向に手足を手配することが重要です。四肢の配置の標準化は、調査員が保存され、被験者と時間の両方に適用できる標準化されたROIの生成および適用できるようになります。 全体的に、我々は、IVISルミナXRがモデル化するために使用する優れたプラットフォームを提供していると確信してマウスのSCI -依存性の骨粗しょう症の発症。 1）より、これらの変更は時間をかけて安定させるかどうかを判断する）SCI後の骨の損失および脱塩、2の時間的性質を理解する、3）の可用性と、探索：同じマウスのコホート内で縦方向に骨の損失を研究する能力は、私たちができるようになりますトランスジェニックとヌルのマウスラインの両方が、恐らく最も重要な利点は、これらの病理学的還元主義的に変化、および4の分子メカニズム）を研究する能力、どちらかの初期段階での骨粗しょう症の発症を予防するために設計された新たな介入をテストを開始傷害の、または、骨粗しょう症はすでに開発された後、このような変更を逆にする。最後に、ルミナXRは、優れたX線イメージングの可能性を提供することに加えて、また生きている動物の両方で生物発光と蛍光シグナルを研究するために使用することができます。一つは、簡単にMULを見て、このシステム内で提供される他のモダリティを組み込む想像できるSCIまたは他の病気のプロセスに続いて機械的に骨のダイナミクスを決定する要因のtitude骨粗しょう症の結果で​​ある。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td>バトラーシャイン動物 健康</td><td> 001848 </td><td></td></tr><tr><td> Ketathesia（ケタミン 塩酸塩） </td><td>バトラーシャイン動物 健康</td><td> 023061 </td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バトラーシャイン動物 健康</td><td> 037849 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivicaine </td><td>バトラーシャイン動物 健康</td><td> 021801 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam; 7MM </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> NC0085178 </td><td>推進するために 時の止血 手術</td></tr><tr><td> IVISルミナXR </td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 135400 </td><td></td></tr><tr><td> ZFOV、2.5 cmのフィールド ビューレンズ</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 127285 </td><td>絶対必要 への高生成 倍率X線 骨の画像 構造は</td></tr><tr><td> QDR骨 密度計</td><td> Hologic </td><td></td><td>モデルは使用されなく 生産の</td></tr></tbody></table>

longitudinal evaluation of mouse hind limb bone loss after spinal cord injury using novel, in vivo, methodology

脊髄損傷（SCI）は、しばしば骨折1のより高い周波数につながる、骨盤と下肢のsublesional地域で骨粗しょう症を伴っている。これらの骨折は、しばしば正常な感覚機能を失っている地域で発生すると、患者は死亡を含む骨折依存病理、リスクが高いです。骨密度（BMD、グラム/ cm 2）を、骨ミネラル含量（BMC、グラム）の両方でSCI -依存性の損失は機械的な廃用2、異常な神経細胞のシグナル伝達3、ホルモンの変化4に起因している。 SCI誘発性骨粗しょう症の齧歯類モデルを使用すると、SCIは、次の骨粗しょう症の開発だけでなく、5月7日新しい治療法（および8にレビュー）を生成するためのテスト環境の基礎となるメカニズムに関する貴重な情報を提供することができます。 SCIのマウスモデルは、メカニズム- BAへの還元主義的なアプローチを可能として、非常に興味深いです。ヌルとトランスジェニックマウスを使用することにより、sedの評価。そのようなモデルは、重要なデータを提供している一方で、SCI後の骨損失の程度を決定する上で低侵襲、、信頼性の高い再現性、そして定量化可能な方法の必要性は、診断を向上させるために、特に時間の経過と実験動物の同一コホート内で、まだある、治療方法、および/またはSCI誘発性骨粗しょう症の予防。 げっ歯類で骨密度を測定するための理想的な方法は、X線放射の低水準に（時間の経過に）シーケンシャル、多重露光を可能にするであろう。この研究は、新しい全体動物スキャナ、低エネルギー（1-3 milligray（線量））高解像度、高倍率X線画像を提​​供するために使用できるIVISルミナXR（キャリパーインスツルメンツ）の使用方法について説明しますマウス後肢の骨のSCIを以下の時間をかけて。無傷、年齢をマッチさせたコントロールと比較して有意な骨密度の低下は、後の脊髄切断10日間でマウスの脛骨に見られた（ナイーブ）マウス（13％減少、P &lt;0.0005）。近位大腿骨の密度の低下が40日後の損傷（7％減少、P &lt;0.05）まで検出可能ではなかったしながら遠位大腿骨の骨密度の低下は、10日目後SCIでも検出可能であった。マウスの大腿骨の密度のSCIに依存する損失は、骨密度測定のための二重エネルギーX線吸収法（DXA）、現在の&quot;ゴールドスタンダード&quot;を使用して事後確認された。我々は、IVISルミナXRを使用して40日後SCIでマウスの大腿骨のBMCの12％の損失を検出する。これは、マウスの大腿骨事後30日後SCI 9日にDXAの分析を使用する以前に報告されたBMCのピカールで13.5％の損失や同僚と比べても遜色。我々の結果は、IVISルミナXRは小説、SCI以下のマウスに後肢の骨密度の長期的、長手方向の測定を行うためのhigh-resolution/high-magnificationの方法を提供することを示唆している。

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Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

成体マウスの大腿骨と脛骨の骨の損失の長手方向の検討は、連続した低線量X線スキャンを使用して、脊髄損傷後実施した。大腿骨の骨量の減少が40日後の傷害まで検出されていないときに脛骨の骨の損失は、試験期間を通じて検出された。

小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

15.1K ビュー.  University of Texas Health Science Center at Houston. 成体マウスの大腿骨と脛骨の骨の損失の長手方向の検討は、連続した低線量X線スキャンを使用して、脊髄損傷後実施した。大腿骨の骨量の減少が40日後の傷害まで検出されていないときに脛骨の骨の損失は、試験期間を通じて検出された。

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

医学

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

生物工学

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The amount of the different tissues in the callus provides important information on the fracture healing progress. Available in vivo techniques to longitudinally monitor the callus tissue development in preclinical fracture-healing studies using small animals include digital radiography and &#181;CT imaging. However, both techniques are only able to distinguish between mineralized and non-mineralized tissue. Consequently, it is impossible to discriminate cartilage from fibrous tissue. In contrast, magnetic resonance imaging (MRI) visualizes anatomical structures based on their water content and might therefore be able to noninvasively identify soft tissue and cartilage in the fracture callus. Here, we report the use of an MRI-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice. The experiments demonstrated that the fixator and a custom-made mounting device allow repetitive MRI scans, thus enabling longitudinal analysis of fracture-callus tissue development.

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

The evaluation of tissue development in the fracture callus during endochondral bone healing is essential to monitor the healing process. Here, we report the use of a magnetic resonance imaging (MRI)-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice.

生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, thereby improving the reproducibility of the experiments.
These methods need two requirements to be fulfilled: clarity of the surgical anatomical pathway and simplicity and convenience of the laboratory device. Crucially for the operator, a clear anatomical pathway provides minimally invasive exposure, which avoids additional damage to the experimental animal during the surgical procedures and allows the animal to maintain a consistent and stable anatomical morphology during the experiment.
In this study, the use of a novel integrated platform called the SCI coaxial platform for spinal cord injury in small animals to expose the T9 level spinal cord in a minimally invasive way and stabilize and immobilize the vertebra of mice using a vertebral stabilizer is researched, and, finally, a coaxial gravity impactor is used to contuse the spinal cord of mice to approach different degrees of T9 spinal cord injury. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

Minimally invasive techniques and a simple laboratory device improve the reproducibility of the spinal cord injury model by reducing operative damage to the experimental animals and allowing anatomical morphology maintenance. The method is worthwhile because the reliable results and reproducible procedure facilitate investigations of the mechanisms of disease reparation.

低侵襲法に基づくマウス挫傷脊髄損傷モデルの確立

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスの自発運動機能障害の定量化

Using the MouseWalker to Quantify Locomotor Dysfunction in a Mouse Model of Spinal Cord Injury

The execution of complex and highly coordinated motor programs, such as walking and running, is dependent on the rhythmic activation of spinal and supra-spinal circuits. After a thoracic spinal cord injury, communication with upstream circuits is impaired. This, in turn, leads to a loss of coordination, with limited recovery potential. Hence, to better evaluate the degree of recovery after the administration of drugs or therapies, there is a necessity for new, more detailed, and accurate tools to quantify gait, limb coordination, and other fine aspects of locomotor behavior in animal models of spinal cord injury. Several assays have been developed over the years to quantitatively assess free-walking behavior in rodents; however, they usually lack direct measurements related to stepping gait strategies, footprint patterns, and coordination. To address these shortcomings, an updated version of the MouseWalker, which combines a frustrated total internal reflection (fTIR) walkway with tracking and quantification software, is provided. This open-source system has been adapted to extract several graphical outputs and kinematic parameters, and a set of post-quantification tools can be to analyze the output data provided. This manuscript also demonstrates how this method, allied with already established behavioral tests, quantitatively describes locomotor deficits following spinal cord injury.

著者スポットライト:MouseWalkerを使用して脊髄損傷のマウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化  

An experimental pipeline to quantitatively describe the locomotor pattern of freely walking mice using the MouseWalker (MW) toolbox is provided, ranging from initial video recordings and tracking to post-quantification analysis. A spinal cord contusion injury model in mice is employed to demonstrate the usefulness of the MW system.

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

The execution of complex and highly coordinated motor programs, such as walking and running, is dependent on the rhythmic activation of spinal and ...

正確なマウスモデルのための脊髄損傷挫傷装置

Automated Impactor for Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Spinal cord injury (SCI) due to traumatic injuries such as car accidents and falls is associated with permanent spinal cord dysfunction. Creation of contusion models of spinal cord injury by impacting the spinal cord results in similar pathologies to most spinal cord injuries in clinical practice. Accurate, reproducible, and convenient animal models of spinal cord injury are essential for studying spinal cord injury. We present a novel automated spinal cord injury contusion device for mice, the Guangzhou Jinan University smart spinal cord injury system, that can produce spinal cord injury contusion models with accuracy, reproducibility, and convenience. The system accurately produces models of varying degrees of spinal cord injury via laser distance sensors combined with an automated mobile platform and advanced software. We used this system to create three levels of spinal cord injury mice models, determined their Basso mouse scale (BMS) scores, and performed behavioral as well as staining assays to demonstrate its accuracy and reproducibility. We show each step of the development of the injury models using this device, forming a standardized procedure. This method produces reproducible spinal cord injury contusion mice models and reduces human manipulation factors via convenient handling procedures. The developed animal model is reliable for studying spinal cord injury mechanisms and associated treatment approaches.

著者スポットライト:脊髄損傷研究におけるイノベーションへの洞察

Presented here is a novel automated spinal cord injury contusion device for mice, which can accurately produce spinal cord injury contusion models with varying degrees.

マウスの挫傷性脊髄損傷モデルのための自動インパクター

Spinal cord injury (SCI) due to traumatic injuries such as car accidents and falls is associated with permanent spinal cord dysfunction. Creation of ...

小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

要約

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

半自動縦マイクロトモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

低侵襲法に基づくマウス挫傷脊髄損傷モデルの確立

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

マウスの挫傷性脊髄損傷モデルのための自動インパクター

小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

要約

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

低侵襲法に基づくマウス挫傷脊髄損傷モデルの確立

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

マウスの挫傷性脊髄損傷モデルのための自動インパクター

半自動縦マイクロトモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折