著者は、博士はジェームズ（Zhijian）に感謝したいと思いますMAVSを含む必須の試薬 ​​、提供するためのチェン（UTの南西、分子生物学） - / -マウスでは、博士漣日を（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、薬理学および分子医学）この研究のためにγHV68の細菌人工染色体を提供するため。

1。 γHV68によるマウス感染<ol><li> 6〜8週齢、性別をマッチさせた同腹マウス（8〜12匹/群）ウイルス感染のために使用されます。マウスは出荷後4日間フル（96時間）の上に順応することができます。 </li><li>ウイルスを使用してプロトコルの手順は標準BSL2予防措置を用いてバイオセーフティレベル2（BSL2）のキャビネットで行うべきである。 </li><li>ただの実験の前に、マウスあたりの滅菌PBS30μlのγHV68のウイルス懸濁液（40〜1×10 5プラーク形成単位[PFU]）を準備します。氷の上でウイルス懸濁液を保管してください。 </li><li>マウスの鎮静をケタミン/キシラジン溶液（1.5 mgのケタミンおよび0.15 mg xylazine/20 g体重、100μL/マウス）を準備します。マウスはつま先のピンチを行うことにより、鎮静されていることを確認します。 </li><li> 1.5mgのケタミンおよび腹腔内注射で20 mgの体重当たり0.15ミリグラムのキシラジン（100μL/マウス）と落ち着いたマウス。 </li><li>滴下には、鼻腔内にウイルス懸濁液（30μL/マウス）を提供鎮静マウスの一方の鼻孔にファッション、。 </li><li> 5用に片側にマウスを置き - 10分肺にウイルスの気道送達を容易にする。 </li><li>背面ケージとモニター、マウスで場所マウス、彼らが完全に鎮静状態から回復したまで。 </li><li>各種日間感染後に、肺の深い意識の死/損失を確保した後にCO 2窒息や収穫によってマウスを生け贄に捧げる。 1.0mmのジルコニア/シリカビーズを500μlを含む滅菌1.5ミリリットルスクリューキャップチューブに場所が肺。氷の上にチューブを保管してください。ストアサンプル-80°Cでの同じ日に、次のステップに進んでいない場合。脾臓または肝臓組織は、実験の時間枠に応じてウイルスの待ち時間の分析のために、この時点で収集することができます。 </li><li>チューブに冷たい無血清DMEM 1 mlを加え、ビーズ鼓動を30秒で肺をホモジナイズする。少なくとも1分間氷上でチューブを冷やす。一度、このプロセスを繰り返します。 </li><li>遠心分離肺は1分間、4℃で16000 rcfでライセートとsupernを使用NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定するatant。 </li></ol> 2。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68多段階増殖速度を決定<ol><li>野生型マウス胚線維芽細胞（MEF）とめっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）密度に対する宿主遺伝子を欠損したものを栽培しています。 </li><li>感染前日に低multipilicityオブ感染度（MOI）のためのよく10,000細胞/ 24ウェルプレートにMEFを分割します。実験は、通常、0.001の間に三重にし、MOIで行われている - 0.05は、通常使用されています。 </li><li>ウイルスの所望量（ウェル当たり0.5ミリリットル）を含むγHV68懸濁液を調製。 </li><li>培地を除去し、ウェルあたりγHV68懸濁液0.5mlでMEFをカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター、岩30分ごとにプレートをインキュベートし、インキュベーションは2時間進行させる。 </li><li>ウイルス懸濁液を取り出して、0.5ミリリットル新鮮cを使用してセルをカバーomplete DMEM培地は8％ウシ胎児血清を含む。 </li><li>各種日間感染後に、滅菌1.5 mlの遠心チューブに培地と細胞を採取。直ちに-80℃でチューブを凍結℃に</li><li> -80℃で凍結させたMEFからリリースγHV68℃、37で解凍℃の水浴とボルテックス。凍結融解の3サイクルは通常のサンプルに適用されます。 </li><li> NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定します。 </li><li>ウイルス力価を読み、MEFの上γHV68多段階成長曲線をプロットします。 </li></ol> 3。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68溶菌複製の分子解剖<ol><li>セクション2の2.6〜ステップ2.1で説明したようにウイルス感染を行います。 </li><li>各種日間感染後に、上清を捨てる。冷PBSおよびトリプシン処理細胞と細胞を洗浄します。 1分間、室温で1,000 rcfで遠心分離により細胞をペレット化。上清を捨て、-80℃で保存細胞℃、 </li><li>以前に公開された方法5,6に従って全DNA（ホストおよびウイルスゲノム）、全RNAを抽出します。 </li><li>全DNAなどのRTA（ORF50）、ORF57とORF60としてウイルス溶解転写産物に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。ホストハウスキーピング遺伝子（例えば、β-アクチン）を参考にし、細胞内γHV68ゲノムの相対量を決定します。 </li><li>ゲノムDNAのコンタミを除去するには、RNaseフリーのDNaseを用いた治療は、トータルRNAおよびオリゴ（dT）11-19プライマーとcDNA調製のために重要である。 RNaseフリーDNaseおよびRT-PCR法を用いた治療を含む、RNA抽出の詳細については5を参照してください。ホストハウスキーピング遺伝子のそれを参考にウイルス転写物の相対量を決定するために、上記のように、cDNAおよびプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。 </li></ol> 4。細菌人工染色体を用いて組換えγHV68を生成変性アルコール常飲者ここで説明するdは宿主ウイルス相互作用に関与しているγHV68遺伝子に変異を導入するために使用されます。 <ol><li> PCRにより中央領域に所望の変異を運ぶ野生型配列または配列のDNA断片（約1.5kb）を準備します。 </li><li>特にMIDIスケールの精製（OriGene）により、目的の遺伝子の遺伝子を不活性化する変異部位の周りトランスポゾン挿入7を含む細菌人工染色体（BAC）を準備します。 4で保存してBAC DNA℃（BAC DNAの融解/凍結を避ける）。 </li><li>トランスフェクトしたBAC DNA、PCR産物は、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いて、γHV68溶菌複製に対して非常に寛容である細胞（例えば、NIH3T3またはBHK21）に興味のある遺伝子の所望の突然変異を含む。 </li><li>細胞変性効果（CPE）が単層で表示されるまで、セルの分割をしてください。ウイルスを含む上清を回収し、必要に応じて、NIH3T3またはBHK21細胞にウイルスを増幅する。 </li><li>とNIH3T3細胞に感染1800 rpmで遠心分離した組換えウイルスは、30℃で30分間。 </li><li>収穫γHV68感染NIH3T3細胞とヒルトのプロトコルを使用して8,9環状ウイルスゲノムを準備します。 </li><li>菅耐性遺伝子がトランスポゾンのときにクロラムフェニコール（Cm）への抵抗であるコロニーのためのエレクトロポレーションと画面によって電気MAX DH10Bコンピテント細胞（Invitrogen）を変換しますが、カナマイシンに対する感受性（菅）（Cm耐性遺伝子は、BACのバックボーンになっている挿入）。 </li><li> chlorophenicolを含む培地でのCM、R、S菅コロニーを成長させ、ミニまたはMIDIスケールの精製（OriGene）でのBAC DNAを調製する。 </li><li>変異部位の隣接領域、および配列に特異的なプライマーを用い、PCR法により標的遺伝子中の所望の変異を確認します。 </li><li>選択された制限酵素およびパルスフィールド·ゲル電気泳動を用いた消化によって、BACには染色体再配列を確認していません。 </li><li>リポフェクタミンとNIH 3T3またはBHK21細胞への組換えBACをトランスフェクション組換えγHV68を準備するために2000（Invitrogen）を。 </li><li> CPEは単層で表示されるまで細胞を継代してください。ウイルスを含む上清を収集し、NIH3T3またはBHK21細胞で組換えγHV68を増幅する。 </li><li>組換えウイルスの力価を測定し、セクション1および2に記載されたウイルスの増殖特性をex vivoおよび in vivo での特徴となっています 。 </li></ol> 5。プラークアッセイによりウイルス力価を決定<ol><li>めっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）の密度にNIH3T3細胞を成長させる。 </li><li>感染前日によく20,000細胞/ 24ウェルプレートに分割したNIH3T3。 </li><li> 8パーセント新生仔ウシ血清（NCS）を含むDMEM培地で10倍に直列に希釈ウイルス上清を準備します。 </li><li>培地を除去し、γHV68懸濁液0.5mlをNIH3T3細胞をカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター、岩の板ごとに30分間インキュベートし、インキュベーションを続行できるよう2時間。 </li><li>ウイルス懸濁液を取り出して、2パーセントNCSおよび0.75％メチルセルロース（Sigma）を含む0.5mlのDMEM培地で細胞をカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター中で静置します。 6日目、感染後にプラークをカウントします。単層の染色、クリスタルバイオレットを持つ例えば、プラークの計数を容易にすることができる。 </li><li>価（PFU / mlで）= D×N個×1000μL/ミリリットル÷Vの添加：次の式を使用して希釈していない組織溶解物または細胞溶解物中のウイルス力価を計算します。 N、適切な希釈でプラーク数の平均値であり、Dは、希釈倍（5など、10、100 .....）、V（μL）、連続的に希釈した上清の体積は当たりも追加。 </li></ol> 6。代表的な結果： - / -マウス10、マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製表現型とrecombin 3つの代表的な数値は、野生型およびMAVSの肺におけるγHV68溶菌複製を含め、ここに示されていますMAVS依存IKKβによって変調されるリン酸化部位内の変異を運ぶアリγHV68。これら三つの裏付けとなる実験は 、in vivo および ex vivo で γHV68溶菌レプリケーションに先天性免疫コンポーネントの役割を定義するためのスキームを構成している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> 図1 MAVS + / +およびMAVSの肺のγHV68負荷- / -マウス。 ）二つの主要な先天性のシグナリングはMAVSの下流経路。順番に、炎症性サイトカインやインターフェロンの遺伝子発現をアップレギュレートするNFκBおよびインターフェロン調節因子（IRFS）を活性化するために細胞質RIG-I様受容体からのシグナルMAVSアダプター分子リレー。 B）はMAVS + / +およびMAVS - / -マウスは阻止された指定された時点で40 PFUの鼻腔γHV68および肺におけるウイルス量で感染させた<html> NIH3T3単分子膜を用いたプラークアッセイによって決定されます。各シンボルは、マウスを表しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> 図2：マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製動態。 MAVS上γHV68の溶菌複製は+ / +およびMAVS - / - MEFには多段階の成長曲線（A）と、定量的リアルタイムPCR（B）によって評価した。両方の実験では、γHV68の等しいMEFの数と量は0.01-多数の感染度（MOI）でウイルス感染のために使用された。 （a）細胞と上清を示した時点で収穫し、ウイルス力価を決定するために、プラークアッセイの対象とされた。 （B）の総RNAをγHV68感染したMEFから抽出され、選択された溶菌転写産物（RTA、ORF57、およびORF60）に特異的なプライマーを用いて、定量的リアルタイムPCRによって分析した。 ig3.jpg &quot;/&gt; 図3IKKγによるリン酸化を廃止RTAのトランス活性化ドメイン内の組換えγHV68運ぶ突然変異の溶菌複製動態。 （A）はMAVSにおける多段階成長換え野生型ウイルスの曲線（γHV68.wt）と変異ウイルス（γHV68.mut）+ / +およびMAVS - / - MEFの細胞（MOI = 0.01）。 MEFのをMOI 0.01でγHV68を感染させた。細胞と上清を指示された時点で収穫し、ウイルス力価はNIH 3T3単分子膜を用いたプラークアッセイにより決定した。 γHV68感染NIH3T3細胞（B）中のγHV68RTAのmRNAレベル（MOI = 0.01）。時間感染後30日時点で、全RNAをγHV68感染NIH 3T3細胞から抽出し、定量的リアルタイムPCRによって分析した。

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	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+latency+and+its+regulation:+lessons+from+the+gamma-herpesviruses.">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li><li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li><li>Strauss, W. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+mammalian+tissues.">Preparation of genomic DNA from mammalian tissues.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).</li><li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li><li>Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+&#946;-herpesvirus+genomes+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Cloning of &#946;-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).</li><li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ウイルス感染に応答して、MAVS依存自然免疫シグナル伝達経路は、10月14日抗炎症性サイトカインの産生を促進するために活性化されています。人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス3,4のモデルウイルスとしてマウスγHV68を使用して、我々はγHV68横取りMAVS-IKKβ経路は転写活性化5を介してウイルス溶解複製を促進することを発?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td>エレクトロポレーションMAXのコンピテントセル</td><td>インビトロジェン</td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマ</td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HPプラスミドミニシステム</td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HPプラスミドミディプレップシステム</td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

ウイルス感染に応答して、ホストがそのような抗ウイルスサイトカイン産生の1,2につながる自然免疫シグナル伝達経路を活性化するなど、様々な防御的な応答を、開発しています。ホストを植民地化するためには、ウイルスは、宿主の抗ウイルス応答を回避し、シグナル伝達経路を操作することが嫌気されています。宿主ウイルス相互作用を解明することはウイルス感染に対する新たな治療戦略の開発に光を当てることになります。 ネズミγHV68は密接に人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスとEpsten-Barrウイルス3,4に関連しています。実験用マウスでγHV68感染はヒトヘルペスウイルスでは利用できませんin vivoにおける宿主応答とウイルス感染、の全過程を調べるために扱いやすい小動物モデルを提供します。このプロトコルでは、表現型の特徴とγHV68溶菌replicでホストシグナル伝達成分の分子解剖のための方法のパネルを提示vivoおよび ex vivoの両方において ation。遺伝的に改変されたマウス系統の有用性は 、in vivo で γHV68急性感染時に宿主シグナル伝達経路の役割の尋問を許可します。さらに、これらの欠損マウス系統から単離されたマウス胚線維芽細胞（MEF）を、さらにγHV68溶菌複製を ex vivoでの間にこれらの分子の役割を分析するために使用できます。 ウイルス学的および分子生物学的アッセイを用いて、我々はホストウイルスの相互作用の分子機構を特定し、ウイルス溶解複製に必須のホストおよびウイルス遺伝子を特定することができます。最後に、細菌人工染色体（BAC）システムは、具体的にホストウイルス作用を中断ウイルス因子（複数可）への変異の導入を容易にします。これらの変異を有する組換えγHV68は主要なホストシグナル伝達成分が欠損したMEFにおけるγHV68溶菌複製の表現型を再現するために使用できます。このプロトコルは 、in vivo および ex vivo における介入の複数のレベルで宿主-病原体相互作用を調べるための優れた戦略を提供しています。 最近、我々はγHV68奪う自然免疫シグナル伝達経路は、ウイルス溶解複製5を促進することを発見した。具体的には、γHV68de novoの感染症は、免疫キナーゼIKKβを活性化し、活性化IKKβは、ウイルスの転写活性化を促進するために、マスターウイルスの転写因子、複製およびトランス（RTA）をリン酸化する。そうすることで、効率的にγHV68カップルの自然免疫活性化をホストするために、その転写活性化は、それによってウイルス転写および溶解複製を容易にする。この研究では、ホスト·ウイルスとの相互作用を調べるために他のウイルスに適用できる優れた例を提供しています。

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス - 宿主相互作用の分子尋問の両方を可能にします。

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. 我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス - 宿主相互作用の分子?...

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Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

免疫・感染学

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

要約

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サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

表現型のハイスループットアッセイ

微生物群集を学びます

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

アン

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

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解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集