NIHグラントR01EY016099と盲目のキャリア開発賞を防止する研究：この研究は国立衛生研究所（NIH）コアグラント（5P30EY008098）と、以下の資金XWのによってサポートされていました。我々は、共焦点イメージングにおける援助のためにキラのラスロップに感謝。

1日目。準備 1。魚の交配を設定する夕方にはゼブラフィッシュのペア十字架を設定します。希望の時間の前にランダムな交配を防ぐために、交配のカセットで、女性と男性の魚を分離する仕切りを使用してください。 GFP -発現するトランスジェニックフィッシュとドナー割球のソースとして使用されます。 pt104トランスジェニックライン（ゾウら 、2008）、ここで使用される、EF1プロモーターの制御下で普遍的にGFPを発現する。 GFPの発現は、ライブイメージングによるドナー細胞の可視化を可能にする。適切な蛍光タンパク質を発現させる他のトランスジェニック魚の行は、特定のニーズに合わせて使用​​することができます。 2。保持する胚のためのくさび形のアガロースの井戸を準備シャーレにE3卵水（ウェ、2007）で調製した溶融1％アガロースを、、注ぐ。アガロース溶液にくさび状突起を持ち、アガロース溶液が完全に固化させプラスチック金型をフロートさせます。慎重に金型を取り外し、E3水でアガロースのベッドを浸す。 3。移植針を準備ガラスキャピラリーピペット（世界の精密機器を）引いて針を作るために11.5電力設定で垂直ニードルプラー（デビッドKopfは楽器を）使用してください。良い針先は長いシャフトでテーパーすべき。内径40 -45μmの傾斜開口部が得られるまでマイクログラインダー（Marishige）と45度の角度で針先を挽く（図1A）。針先をクリーンアップするには、吸うと表示されているすべての残骸が削除されるまで10％フッ化水素酸溶液を解放して注射器にホースを接続し、針の平滑末端にホースを取り付け、と。次に、100％エタノール、続いて蒸留水でのヒントを洗う。すべてのエタノールが蒸発するまで針を空気乾燥させる。残留エタノールは、高温の研磨工程の間に針を台無しにする：ヒントが完全に乾いていることを確認することが重要です。針の先端のギザギザを柔らかくし、研磨する、マイクロ捏造（Marishige）のフィラメントによって発生する熱と針の先端を焼く。針の先端が研磨中にフィラメントを接触させてはいけません。フィラメントと針の先端との間のフィラメントとの距離も通過する電気の量は、所望の加熱条件を達成するために調整することができます。温度が高すぎるすべきではない：これは、針の先端を溶融して変形します。粗いエッジが平滑化された後、慎重に針の先端に加熱されたフィラメントに触れ、その後穏やかに先端（図1B）を生成するために針から離れてフィラメントを引き出します。 、シャープな滑らかな、そしてきれいな針はそのままドナー割球を得るためと宿主胚を損傷しないために重要です。 4。胚位置決めプローブを準備滑らかに端を細いガラスプローブを得るためにガスの炎を介してガラスピペットを引き出します。このプローブは、移植に先立って適切な向きに胚を配置するために使用されます。 2日目。割球移植 1。収集とdechorionate胚翌日、チームメイトに魚を可能にするクロスカセットに仕切りを削除する。 E3水を満たしたシャーレに胚を置きます。その後、手動で微ピンセットで胚からchorionsを離れて引き裂くことによりdechorionate胚。慎重にアガロースウェルにdechorionated胚を転送するために曲がったシャフトをガラスピペットを使用してください。バーストに胚を引き起こす空気と胚、任意の接触を避ける。胚は28.5で開発℃で3時間後に受精、またはHPFになるまでアガロース井戸でCをしましょう​​。 2。移植装置を設定する胚が発達しながら、鉱物油で満たされたマイクロポンプシステムへの移植の針を接続することにより、移植装置を設定します。システムがリークされず、空気の泡がシステムの中に閉じ込めされていないことを確認します。先端開口部のスペースを1μl - バック0.5を除いて、ミネラルオイルを全体移植針を埋める。 3。割球の移植割球を移植する、上方3 - 4 - HPFの胚の割球側をオリエンテーションするガラスの位置決めプローブを使用してください。その後、そっとドナー胚に移植針を挿入し、ゆっくりと針に5〜20割球を吸い上げる。宿主胚に割球を充填した針を挿入し、徐々に割球を離します。彼らの子孫が後の発達段階でローカライズどこ割球がリリースされるサイトが影響します。網膜と脳の発達、動物極でのリリースの細胞を分析する。移植時に、針の先端が空気に接触しないことを確認してください。機械的損傷を最小限に抑えるために、宿主胚は、次の日まで、28.5 ° Cでアガロースのウェルに残されるものとする。次に、t各ウェル内の1つの胚を、1％アガロース、0.5 mlのプレコートした24ウェルプレートにモザイク胚のケース温度。 E3卵の水1 mlを各ウェルに追加されます。細菌感染を防ぐために、E3卵の水に100倍のペニシリンとストレプトマイシンの10μlを加える。 3日目。埋め込みとモザイク胚のライブイメージング 1。埋め込み胚 E3卵の水に1.5％低融点アガロース（LMP）を準備し、30℃の水浴でソリューションを維持。厚さ0.17ミリメートル（世界の精密機器）のグラスの底部とFluoroDish組織培養皿にモザイク胚を移す。ちょうどE3の最小限の量でカバー胚を残すために余分なE3の水分を取り除く。胚30〜50μlを溶かした1.5​​％LMPを追加。アガロース溶液が固化する前に、可能な限り迅速にガラスの底の近くに眼や脳を配置します。解決策が冷却した後、さらに場所の胚を確保するために追加のアガロース溶液を加える。その後、2〜3ミリリットルE3の卵の水で固化したアガロースブ​​ロックを浸す。 2。共焦点像共焦点顕微鏡の場合は、大規模な焦点深度の水浸反転目標（オリンパス、PlanApo、40 X/0.90 WLSM、日本）が使用されます。水の滴は、客観的に追加して、客観的にFluoroDish組織培養皿を置いています。画像の開発に、胚の写真を撮り、5分ごとにタイムラプスイメージングを行う。実験の性質に応じて、ショットの間の時間間隔を調整する必要があります。 代表的な結果図2は、代表的な24 - HPFモザイクのゼブラフィッシュを示しています。 GFPの発現は、緑のドナー細胞を強調。網膜神経上皮細胞は網膜の壁の厚さ全体に及ぶ。 映画は24 HPFでのホストの脳におけるドナー細胞の動きを示しています。時間をかけて細胞の形態変化に注目してください。 <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。移植の針先の形状。 A.は、針の先端の斜めの開口部は、フッ酸洗浄後の残骸の自由だ。 B.先端が針の先端に生成されました。 <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。24 HPFにおけるキメラゼブラフィッシュの胚におけるGFP発現ドナー細胞の可視化。左側のパネルには、脳と網膜におけるGFPのシグナルを示しています。中央のパネルには胚の明視野像である。右側のパネルには、マージされた画像を示しています。 映画は1。GFP陽性ドナー細胞のイメージングが開発中の脳の神経上皮細胞の形態には大きな変更を示したライブ。映画の個々のフレームは、24及び25 HPFの間に5 ​​分ごとに収集された。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">映画を見るにはここをクリック</a> 。

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

このビデオでは、我々はゼブラフィッシュの網膜や脳の発達を分析する割球移植する方法を示しています。このプロトコルはまた、単に、ホスト胚の対応する場所にドナー割球を放出することによって、他の組織や器官の発達を分析するために使用することができます。 GFP分子による標識は、蛍光色素標識デキストラン（ホーとケイン1990）で標識よりクリーンなバックグラウンドをもたら?...

E3の卵の水： <ul><li> 5mMのNaClを</li><li> 0.17 mMのKClを</li><li> 0.33 mMのCaCl 2を </li><li> 0.33 mMのMgSO 4を </li><li> 0.1％メチレンブルー</li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

細胞は、胚形成の間にその場所とプロパティで広く変わる。これらの変化は、細胞とその環境との相互作用によって調節される。異なる遺伝的背景のセルで構成されているキメラ胚は、、、目的の遺伝子により媒介される細胞間相互作用を研究するための優れたツールです。初期の発達段階におけるゼブラフィッシュの胚の透明性は、細胞レベルでの組織や臓器の形態形成の直接可視化を可能にします。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚におけるキメラ網膜と脳を生成するために、ドナー細胞のライブイメージングを実行するプロトコルを示しています。プロトコルは、移植針、GFP陰性のホストへのGFP発現ドナー割球の移植、およびライブ共焦点顕微鏡下でドナー細胞の挙動の試験の準備をカバーしています。若干の修正で、このプロトコルはまた、ゼブラフィッシュの他の組織や臓器の胚発生を研究するために使用することができます。ラベルのドナー細胞にGFPを使用する利点についても説明します。

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K ビュー.  University of Pittsburgh. 我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。

ビデオ: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

発生生物学

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

<meta charset="utf8"></head><body>再生・開発研究のための堅牢なゼブラフィッシュ細胞移植

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:発生および再生中のゼブラフィッシュ神経系における細胞接続性のマッピング

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

要約

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多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

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多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化