マカク血とPBMCサンプルの博士PramodさんNehete夫妻バーティNehete、この作業は、部分的にNIHの助成金AI 46969からの資金によって支えられて、そしてすべての細胞培養培地は、中央メディア研究所で生産され、NIHの助成CAによって資金を供給され16672。

1）細胞調製と抗原刺激、2）表面マーカーの染色、3）細胞内サイトカイン染色、4）フローサイトメトリー：合計だけでなく、T細胞のメモリーのサブセットの詳細な表現型および機能解析のための手続は、4つの部分に分けることができます。分析。 1。細胞調製と抗原刺激<ol><li>両方たての分離だけでなく、凍結保存された末梢血単核細胞（PBMC）は、このプロトコルで使用されていました。 PBMCをFicoll -ハイパック（Histopaquen - 1077、Sigma - Aldrich社、セントルイス、MO）を用いて密度勾配沈降によるアカゲザルのヘパリンまたはクエン酸静脈血サンプルから単離された。 PBMCのアリコートを液体窒素で90％FCS、10％DMSO中で凍結保存した。 </li><li>低温保存されたPBMCを使用する場合は、冷凍PBMCのバイアルを液体窒素から取り出し、そして急速に穏やかに混合し、37℃の水浴中で解凍、凍結培地を除去するRPMI - 1640（HyClone研究所、ローガン、ユタ州）で洗浄し、完全なメディアに再懸[CM、10％を含むRPMI - 1640サプリメント熱不活化FCS（HyClone研究所）、2mMのL -グルタミン（Sigma - Aldrich社）、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）、および6で培養 - ウェル組織培養プレート37℃で一晩加湿5％CO 2雰囲気でC。翌朝は、生存細胞数をトリパンブルーの色素排除法により決定し、CMに再懸濁した。 </li><li>細胞は、サイトカインの分析に続いて抗原特異的刺激に対する非特異的なために異なる方法で処理した：（a）ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）とイオノマイシン（I）（シグマ - アルドリッチ、セントルイスとの非特異的刺激に対してルイ、MO）、0.1ミリリットルの量で細胞のアリコート（1.0 × 10 6細胞/ウェル）を96ウェル組織培養プレート（BD Biosciences社、フランクリン湖、ニュージャージー州）の個々のウェルに播種した。 PMAとイオノマイシンは、それぞれ、50ng/mlおよび500ng/mlの最終濃度で使用されていました。 96ウェル組織培養プレートの最終的な総量は0.2ml/wellです：（b）の抗原特異的刺激の場合、容積1.0mlに1.0 × 10 6細胞を24ウェル組織培養プレート（BD Biosciences社の個々のウェルに播種した、井戸が以前に変更9で説明したように前処理したフランクリン湖、NJ）、。簡単に言えば、24ウェル組織培養プレートは4の50mmのTris溶液で2.5μg/ mlの/ウェルのヤギ抗マウスIgG（H + L）（キルケゴールとペリー研究所、ゲイサーズバーグ、MD）（PH 8.6）で被覆した° C一晩。プレートは滅菌PBSと共刺激抗体CD49dは、クローン9F10（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）で2回洗浄した翌朝は、37℃で一時間インキュベートすることにより、10μg/ mlの時に追加/よく続いていた℃でインキュベーション後、プレートを室温で滅菌PBSで2回洗浄した。 six HIVエンベロープペプチド8のカクテルを含む、対象の抗原は、（各ペプチドの10μg/mlの最終濃度で添加した。単独でCMのセルを持つ追加の井戸をネガティブコントロールとして調製した。24各ウェルの最終的な合計容積ウェル組織培養プレートは1.0 mlであった。 </li><li>細胞は37℃、加湿5％CO 2雰囲気で、Cで6時間培養した。ブレフェルジンAは、（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO）刺激の最終的な4.5時間のために10μg/mlで培地に添加した。その後、細胞を5 mlのポリプロピレンチューブに移し、冷たい（4℃）フローの洗浄緩衝液（ダルベッコPBS（DPBS、 カルシウム /マグネシウム2 -無料で洗浄し、2％熱不活性化と生活の技術を、ロックビル、MD）その後FCS）、および様々な蛍光標識抗体で染色するために処理。 </li></ol> 2。染色免疫蛍光表面マーカー<ol><li>刺激された細胞は、最初の4で1UL LIVE / DEAD修正可能なアクア蛍光反応性色素で染色した℃で30分間、暗所でC、コールドフローの洗浄緩衝液で1回洗浄。 </li><li>その後、次のように適切に滴定する蛍光標識モノクローナル抗体を細胞に添加した：抗CD3 PE - Cy7（SP34 - 2）、抗CD8 Alexa700（RPA - T8）、抗CD28 PerCP - cy5.5（L293） 、抗CD95 APC（DX2）と抗CD4パシフィックブルー（OKT4）、（サンディエゴ、カリフォルニア州）eBioscience社からCD4除くBD Biosciences社（フランクリン湖、NJ）からすべて、パシフィックブルー（OKT4）。細胞は暗所で4℃で30分間℃でインキュベートした。 </li><li>各実験のために報酬のコントロールと蛍光マイナス1（FMO）の両方は、10,11が利用されて制御します。補償のコントロールは、他の検出器に汚れ、個々の波及coeffecientsを決定するために利用された。補償制御の場合は、サルのいずれかから細胞懸濁液を含むチューブの完全なセットが個別に単一の色の染みのような蛍光コンジュゲート抗体で染色した。 FMOは、すべての試薬が関心のいずれかを含む多色染色の組み合わせであり、正の間の境界を決定するために使用されます自家蛍光レベルと完全に染色されたサンプル中に存在するデータを複製することで、ND負の人口。 </li><li>染色した細胞はその後、コールドフロー洗浄バッファーで洗浄し、固定/膜浸透溶液（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）で修正された（この段階で細胞を4℃で一晩保存することができます° Cを暗所で）少なくとも10分間細胞内サイトカイン染色を行う前に。 </li></ol> 3。細胞内サイトカインの染色<ol><li>固定された細胞はフローの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、紹介予定/（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）洗浄バッファーを製造者の指示に従って追加されました。簡単に言えば、細胞は4℃で10分間1Xパーマ/ Wash Bufferを0.1ミリリットルでインキュベートした。·ダークのC。 </li><li>その後、細胞を4℃で60分間、適切に滴定し、FITC標識抗IFN -γ（B27）と抗IL - 2、PE標識（MQ1 - 17H12）とともにインキュベートした。·ダークのC。 </li><li>その後、細胞は細胞膜透過液でさらに2回洗浄し、 </li><li>最終洗浄後、細胞をDPBSで1％パラホルムアルデヒドで再懸濁し、24時間以内にフローサイトメトリー分析にかけた。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー分析<ol><li>またはシアンADP（Dako社、カーピンテリア、カリフォルニア州）、染色した細胞はLSR IIフローサイトメーター（サンノゼ、カリフォルニア州BD Biosciences社）に買収された。 FACSデータがFlowJoソフトウェア（木スター、オレゴン州アッシュランド）を用いて分析した。 </li><li>図。 1は、代表的な動物とは異なるT細胞サブセットの解析に利用さゲーティングスキームを示しています。リンパ球は前方散乱光（FSC）対側方散乱（SSC）を介して第ゲートであり、その後のライブリンパ球は、SSCとアクア陰性人口に基づいて同定された。 T細胞はCD3 CD4の検出+ CD8 -（CD4 + T細胞）に続く発現とCD4 - CD8 +（CD8 + T細胞）によってその後CD3 + T細胞集団内の個体積極的に同定された。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、さらにナイーブ（Tnは、CD28 + CD95 -）、中央のメモリ（TCM、CD28 + CD95 +）とエフェクターメモリー（TEM、CD28 - CD95 +）細胞と同様にCD28とCD95の発現に基づいて異なるサブセットに区別された文献5、10で説明しています。 </li><li>図。 CD4 +およびCD8 + T細胞の異なるサブセットがPMAとイオノマイシン（PMA + I）による刺激に応答サイトカイン産生の点で機能的能力（INF -γおよび/またはIL - 2）について評価されたかを図2に示す。 </li></ol> 5。代表的なFACSデータアカゲザルのPBMC組成物は、FACS分析を用いて決定した。図1は、代表的な動物とは異なるT細胞サブセットの解析に利用さゲーティングスキームを示しています。リンパ球は前方散乱光（FSC）対側方散乱（SSC）を介して第ゲートであり、その後のライブリンパ球は、SSCとアクア陰性人口に基づいて同定された。 T細胞は、その後、CD3の発現により同定した。 CD4 + CD8 -（CD4 + T細胞）とCD4 - CD8 +（CD8 + T細胞）はCD3 + T細胞集団内の個体数も測定した。図2に示すように、CD4 +およびCD8 + T細胞は、さらにナイーブ（Tnは、CD28 + CD95 -）、中央のメモリ（TCM、CD28 + CD95 +）とエフェクターメモリー（TEM、などのCD28とCD95の発現に基づいて異なるサブセットに区別されたCD28 - CD95 +）細胞。図2Aは、INF -γを示し、非刺激およびPMA /イオノマイシン刺激CD4 + T細胞、およびサブセット、および図2Bにおいて、IL - 2産生は、INF -γおよび非刺激およびPMA /イオノマイシンはCD8を刺激+ T細胞におけるIL - 2産生を示し、およびサブセット異なるサイトカインプロファイルは、各サブセットの刺激によって誘発さに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> アカゲザルmacqauesのPBMC成分のフローサイトメトリー解析に使用する図1。ゲーティング戦略。してください<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="図2a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="図2b" border="0" /> 図2。 （A）総CD4 + T細胞とサブセット。のサイトカイン産生プロファイル合計CD8 + T細胞とサブセットの（B）サイトカイン産生プロファイル。してください<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">ここをクリックして</a>大きな2aのバージョン、見て<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">ここにまたはを</a>図2bの大きいバージョンのために。

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	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

ソリューションおよびバッファ<ul><li>フィコール - ハイパック（Histopaquen - 1077、Sigma - Aldrich社、セントルイス、MO） </li><li> RPMI - 1640培地（HyClone研究所、ローガン、ユタ州） </li><li>ウシ胎児血清（FBS）、（HyClone研究所、ローガン、ユタ州） </li><li> L -グルタミン（Sigma - Aldrich社、セントルイス、MO） </li><li>ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州） </li><li>トリパンブルー試薬（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO） </li><li> 50mMのトリス、pH 8.6、4でフィルタリングし、店舗° C </li><li>ダルベッコPBS（DPBS、Ca2/Mg2-free、生活技術、ロックビル、MD） </li><li>フローの洗浄緩衝液：2％FBSとDPBSサプリメント、4℃で保存</li><li> BD Cytofix / Cytoperm固定/透過処理ソリューションキット（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li></ul>活性化剤<ul><li>ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）（Sigma - Aldrich社、セントルイス、MO） </li><li>イオノマイシン（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO） </li><li>共刺激抗体CD49dは、クローン9F10（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li>アフィニティー精製抗体のF（ab）ヤギ抗 - マウスIgG（H + L）の2フラグメント（キルケゴールとペリー研究所、ゲイサーズバーグ、MD） </li><li>特異的活性化剤は、ペプチドのプール、単一のペプチド、または蛋白質全体を含めることができます</li></ul>サイトカイン分泌の阻害<ul><li> Brefedin A（BFA、シグマアルドリッチ、セントルイス、MO） </li><li>ゴルジプラグは（;サンノゼ、カリフォルニア州BD Biosciences社）代わりに使用することができます。 </li></ul>抗体<ul><li> LIVE / DEAD修正可能なアクア蛍光染色キット（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州） </li><li> CD3 PE - Cy7（SP34 - 2）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li> CD4パシフィックブルー（OKT4）、（eBiosciences（サンディエゴ、カリフォルニア州） </li><li> CD8 Alexa700（RPA - T8）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li> CD28 PerCP - cy5.5（L293）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li> CD95 APC（DX2）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li> IFN - FITC（B27）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li><li> IL - 2のPE（MQ1 - 17H12）、（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州） </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

アカゲザルのモデルは、ワクチンや治療薬の開発のためだけでなく、病態の理解に関して、現在HIV - AIDSのための最善の利用可能なモデルです<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;。ここで、我々は、細胞性免疫応答の詳細な表現型および機能解析、CD4で特に細胞内サイトカイン産生+およびCD8 + T細胞だけでなく、個々のメモリのサブセットのための方法を説明します。我々は、インターフェロンγ（INF -）とインターロイキン（IL）CD4 +とCD8の両方で-2 PMAプラスイオノマイシン（PMA + I）で刺激したアカゲザルPBMCから+ T細胞の生産のための正確な定量的および定性的な措置を得た。サイトカインプロファイルは、メモリセルの異なるサブセットに異なっていた。さらに、このプロトコルは、我々の研究室で開発されたHIVエンベロープペプチドのカクテルのワクチンで免疫したアカゲザルからPBMCサンプル中に抗原特異的CD4 +およびCD8 + T細胞サブセットの些細な分画を示すために感度を提供する。多色フローサイトメトリー法は、T細胞の異なる集団を正確に識別するための強力なツールです。<sup&gt; 4,5</sup&gt;サイトカイン産生能力を持つ<sup&gt; 6</sup&gt;非特異的または抗原特異的刺激後<sup&gt; 5,7</sup&gt;。

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

我々は、合計だけでなく、アカゲザルのCD4 +とCD8 + T細胞、HIV /エイズワクチン研究のための理想的なモデルのメモリのサブセットの詳細な表現型と機能解析のための多色フローサイトメトリーの有用性を実証する。

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.1K ビュー.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. 我々は、合計だけでなく、アカゲザルのCD4 +とCD8 + T細胞、HIV /エイズワクチン研究のための理想的なモデルのメモリのサブセットの詳細な表現型と機能解析のための多色フローサイトメトリーの有用性を実証する。

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Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析<sup&gt; +</sup&gt;ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

免疫・感染学

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

生物工学

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

医学

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

要約

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サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量⁺ T 細胞孤立したアカゲザルから

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラーフローフローサイトメトリーを用いた定量化

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイトメーターによる測定

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

CD4 の分離⁺ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

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サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量⁺ T 細胞孤立したアカゲザルから

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラーフローフローサイトメトリーを用いた定量化

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイトメーターによる測定

CD4 の分離⁺ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット