我々は、自然科学と工学研究評議会（NSERC）と財政支援のためのカナダの癌協会に感謝します。 SCCS感謝NSERCとVNL感謝大学院奨学金のためのオンタリオ大学院奨学金（OGS）プログラム。 ARWは、カナダのリサーチチェアのためにCRCを感謝します。

パート1：デバイスの作製<ol><li>ピラニア溶液中で清浄なガラス基板（3:1濃硫酸：30％過酸化水素）。頻繁に攪拌しながら10分間ピラニア溶液中で基質にしておきます。 </li><li>脱イオン（DI）水で洗浄し、N 2ガ ​​スで基板を乾燥した後、クロム蒸着（250nmの厚さ）のための電子ビームチャンバー内の基板を置きます。 </li><li>クロムコーティングされた基質を脱水し、115℃で5分間ホットプレート上で焼いてからイソプロパノールで洗浄し、℃の</li><li>スピンコーティング（30秒、3000回転）により、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）で基板と素数を乾かします。シプリーS1811フォトレジストで再びスピンコート（同一のパラメータを使用して）。 </li><li>プリベークホットプレート（100℃、2分）で、基板と、パターンマスクを介して5秒間紫外線（UV）照射への暴露によってフォトレジスト。 </li><li>純水で3分間と洗浄のためのシプリーMF 321開発者のUVに曝露基板を開発する。 100℃のホットプレート上でポストベーク℃で1分間。 </li><li> 30秒のためにクロムエッチング液に浸漬することによって公開されているクロムエッチング残りのフォトレジストを除去するために10分間AZ300Tストリッパーに浸漬し、DI水ですすいでください。 DI水ですすぎ、N 2ガ ​​スで乾燥した。 </li><li>預金2から5μmのクロムをパターン化基板のベアリング上に化学蒸着によるパリレン- C（絶縁性ポリマー）。預金スピンコーティングによるテフロンAFの50 nmの（表面の疎水性を作るために）60秒2000rpmで解決策（フロリナートFC - 40の1％重量/重量）ホットプレート上でポストベーク（160℃、10分）。 </li><li>トッププレートを形成するために、コートのような上記非パターニング酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板上50nmのテフロンAF、。 </li><li>ポストベークのホットプレート上で両方の基板（160℃、10分）。 </li></ol>パート2：デバイスのセットアップおよび自動化<ol><li> &quot;二皿&quot;の構成で運用デジタルマイクロ流体デバイスでは、1滴がボトム基板（パターン化電極を有する）と上部基板（一般的にITOから形成された一つの連続した、透明電極、と）の間に配置されています。 </li><li>デバイスを設定するには、メスで優しくこすることにより底部基板のコンタクトパッドからのポリマーコーティングを取り除く。カップル40ピンコネクタ（図1a）と底部基板の露出パッドを。 </li><li>電源投入時にLabVIEW（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）、自作のコントロールボックス（ナショナルインスツルメンツのDAQPadをからの信号によって制御される高電圧リレーの配列を特色にする）、ファンクションジェネレータ、およびアンプを実行しているコンピュータ。コンピュータ/コントロールボックスは、100 V RMS / 40ピンコネクタを介してデバイスに18 kHzの信号のアプリケーションをユーザが制御を容易にします。 </li><li>底部基板のエッジに配置両面テープの2つ（140μmの総厚を）して、デバイスを組み立て、無地ITOスライド（トッププレート）で完了します。 </li><li>制御システムを初期化するには、フィードバック制御を校正するには、LabVIEWのキャリブレーションプログラムを（社内で作成）を実行します。 </li><li>適切な貯水池（以下のセクション3を参照）に試料と試薬をロードし、上部基板（テフロンコーティングされた面が下向き）で囲みます。上部基板にアースコネクタを取り付けます。 </li><li> LabVIEWでの作動のコードを（社内で作成）をロードし、液滴の作動を開始するプログラムを実行します。 </li></ol>パート3：サンプルと試薬の調製<ol><li> 100mMのTrisHCl（pH7.8）中および0.08％プルロニックF127 w / vの：作業バッファ（WB）を準備する</li><li>図1bに示すように、デバイス上でタンク1（R - 1）にWBとピペットのサンプルで分析するタンパク質（s）を、溶解する。 </li><li> R - 2に沈殿剤、20％トリクロロDI水で酸（TCA）、およびピペットを準備します。 </li><li> R - 4にバッファ、70/30クロロホルム/アセトニトリル（ACN）とピペットを洗う準備する。 </li><li> R - 5にresolubilizingバッファ、100 mM重炭酸アンモニウム（pH8.0）におよび0.08％プルロニックF127 W / V、およびピペットを準備します。 </li><li> R - 6にWBとピペットで10 mMで還元剤、 トリス （2 -カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を、溶解する。 </li><li> R - 7にWBとピペットで12 mMでアルキル化剤、ヨードアセトアミド（IAM）を、溶解する。 </li><li> R - 8への総タンパク質試料の濃度（上記、3.1参照）とピペットのTO1 / 5と同じ濃度でWBにトリプシンを溶解する。 </li></ol>パート4：デジタルマイクロ流体サンプル処理<ol><li>次の手順は、社内で書かれたLabVIEWコードによって自動的に実装されています。貯水池から分注された液滴の体積は、電極の大きさ（この場合は、液滴が〜600nLいる調剤）によって定義されます。 </li><li> R - 1からの蛋白質含有試料の液滴とR - 2（図2、フレーム1）から沈殿剤の液滴を分注する。 two滴をマージして組み合わせて液滴がPRの降水量で、その結果、5分間インキュベートすることができます表面にoteins（図2、フレーム2-3）。廃液溜め、R - 3（図2、フレーム4）に離れて沈殿したタンパク質から上清を作動させる。 </li><li> R - 4から洗浄緩衝液の三液滴を分注し、廃液溜めに沈殿したタンパク質を介してそれらを駆動する、R - 3（図2、フレーム5）。 </li><li>沈殿物を乾燥することができます、そしてR - 5からタンパク質へresolubilizingバッファーの液滴を分注する。沈殿物は（図2、フレーム6）に溶解するまで、バッファが20分間インキュベートすることができます。 </li><li> R - 6から還元剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。円形のパターンで6電極間にそれを作動させることによって結合された液滴を混ぜる。液滴は、加湿チャンバー（図3、フレーム1-2）で、室温で1時間インキュベートすることができます。 </li><li> （4.5のように）混合して、R - 7からアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。光（図3、フレーム2-3）から保護され、液滴は、加湿チャンバー中、室温で15分間インキュベートすることができます。 </li><li> R - 8からトリプシンの液滴を分注し、と（4.5のように）混合し、サンプル液滴にマージ。液滴は、37℃で3時間インキュベートする° Cのホットプレート上で加湿チャンバー（図3、フレーム3-4）に許可する。 </li></ol>第5部：ポストプロセッシングサンプル調製<ol><li>水中では2.5％トリフルオロ酢酸0.6 mLを加えることによって上部基板とクエンチの消化反応を取り外します。 </li><li>製造元の指示に従ってC18 ZipTipsを（ミリポア、ビルリカ、MA）を使用して急冷反応生成物を精製する。 </li><li> 100mlの最終容量に純水で試料を精製希釈する。 </li></ol>第6部：質量分析<ol><li>タンデム型質量分析計に交尾ナノHPLC上で処理されたサンプルを評価。 HPLCシステムは、Eksigent Technologies社からのものであり、トラップカラム（3mmの直径。C18ビーズ、150μmのID × 2.5センチ）と逆相分離カラム（3μmの径。C18ビーズ、75μmの内径xが装備されてここで使用15cm）に。ここで使用される質量分析装置は、サーモフィッシャーサイエンティフィックからLTQです。 </li><li>水中に5％のアセトニトリルを構成する移動相で5μL/minでトラップカラムに2μLのサンプルをロードします。 20％アセトニトリルから25分以上80％アセトニトリルの直線勾配を用いて0.5μL/minで逆相カラムでサンプルを分離。さらに10分間80％アセトニトリルで実行を継続。 </li><li>タンデム質量分析法によってカラムをオフに溶出するバンドを分析する。仕事でここに報告された、溶離液はNewObjectiveからナノエレクトロスプレーエミッタ（10μmのIDにテーパー20μmのID）を介して質量分析計にサンプリングされます。 </li><li> SEQUESTなどのデータベース検索プログラムを使用してサンプル中のタンパク質を識別する。本研究では、我々はBioworks 3.01（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に組み込まSEQUESTのバージョンを使用し、同定されたタンパク質は、1.0E - 03未満の確率のスコア（99.9％信頼区間に相当）、および時のシーケンスカバレッジを持っていた少なくとも30％（図4）。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> 図1（a）の画像が自動化された液滴の作動のための40ピンコネクタにDMFのデバイスを交配。 （b）デバイスの回路図は、サンプルやプロテオミクス精密検査に必要な試薬のポジショニングを描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> 映画から図2。フレームは、20％TCA（沈殿剤）と30分の70％のクロロホルム/アセトニトリル（溶液をリンス）の自動抽出とBSAの精製を描いた。フレーム6で、沈殿したタンパク質は100 mM重炭酸アンモニウムの液滴に再溶解されています。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> 図3。逐次還元、アルキル化、およびresolubilizedタンパク質の液滴の消化を示す映画のフレーム。この図では、試薬は、わかりやすくするために染料で着色され、実際には、試薬の色ではありません。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> デジタルマイクロフルイディクスで処理されたウシ血清アルブミンのサンプルの図4。MSのクロマトグラム。 25種類のペプチド（99.9％信頼区間）は44％の対応するシーケンスの範囲を同定した。

<ol>
	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

プロテオミクスにおける標準化されたサンプルの取り扱いと処理の欠如は、フィールドのための主要な制限です。さらに、従来のマクロスケールのサンプルの処理は、サンプルの損失や汚染につながることができる複数のコンテナおよびソリューションの移転を伴います。これらの問題に対する潜在的な解決策は、デジタルマイクロ流体1（DMF）に依存するサンプルの処理のための統?...

digital microfluidics for automated proteomic processing

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断と予後に有用となるバイオマーカーの発見を約束し、重要な新しい学問分野として浮上している。臨床プロテオミクスの手法が広く異なりますが、一般的な特徴は、非常に不均質流体（すなわち血清、全血、等）と分析に先立って（ⅱ）大規模な生化学的な処理からのタンパク質の抽出（I）が必要です。ここで、我々は臨床プロテオミクスで使用されているいくつかの処理ステップを統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）ベースの方法を報告する。これは、タンパク質抽出、溶化、還元、アルキル化および酵素消化を含みます。デジタルマイクロ流体は、ナノリットルマイクロリットルサイズの液滴を開いて表面上で操作されているマイクロ流体処理技術です。液滴は、誘電体層によって被覆されている電極の配列の上に配置されています - 電位が液滴に印加されると、電荷は誘電体の両側に蓄積する。料金は、液滴の位置を制御するために使用できる静電ハンドルとして機能し、シリーズ内の電極のシーケンスをバイアスすることで、液滴は、ディスペンス移動、マージ、ミックス、そして表面上に分割させることができます。従って、DMFは急速な、シーケンシャル、多段階、小型自動生化学的アッセイを行うための自然なフィット感です。これは、従来の方法（手動ピペッティングまたはロボットに依存する）よりも大幅に進歩を表しており、臨床プロテオミクスに有用な新たなツールとなる可能性があります。 玉蜀黍J. Jebrail、ヴィヴィアンN.ルック、そしてスティーブCCシーズーは、この作品にも同様に貢献した。 セルジオLSフレイレの現在のアドレスは600サウス43rdストリートに位置するフィラデルフィア科学大学、フィラデルフィア、PA 19104にあります。

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

電界印加による電極のアレイに - デジタルマイクロ流体は離散液滴の操作（ML〜NL）によって特徴付けられる技術です。それは急速な、シーケンシャル、小型自動生化学的アッセイを行うために非常に適しています。ここで、我々はいくつかのプロテオミクス処理ステップを自動化することのできるプラットフォームを報告する。

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  University of Toronto. 電界印加による電極のアレイに - デジタルマイクロ流体は離散液滴の操作（ML〜NL）によって特徴付けられる技術です。それは急速な、シーケンシャル、小型自動生化学的アッセイを行うために非常に適しています。ここで、我々はいくつかのプロテオミクス処理ステップを自動化することのできるプラットフォームを報告する。

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

生物学

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

電気生理学的にマイクロ流体の適用

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

マイクロ流体を使用した新規治療用途の開発

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

タンパク質の電気泳動分離

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

イムノブロット解析

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

ゲルでタンパク質を染色

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

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Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

要約

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