この作品は、日本の財団法人上原記念生命科学財団（ESの）だけでなく、ホワイトホール財団、神経疾患や脳卒中の国立研究所とスタインハイマー基金賞（BSKまで）によってサポートされていました。

実験手順実験手順は以下のステップ賢明な方法で説明されている2つのキーの部分で構成されています。 パート1：はPREPARING海馬アストロサイトの培養簡単に言えば、混合海馬アストロサイトニューロン培養物を、十分に確立されたプロトコル1,2,3を用いて調製した。我々は、健全な培養アストロサイトを生成する手順を最適化。以下に記載されているすべての手順は、このような層流フードのような無菌環境で実施されるべきである。 準備カバースリップ <ul><li> 22 mmのカバースリップ（VWR、48380〜068） </li><li>ポリ- D -リシン（PDL、シグマP0899）、アリコート（1 mg / ml）を</li><li>ラミニンアリコート（20μg/ ml）を1 mg / mlのラミニン溶液（シグマL2020）に滅菌水49 mlを追加し、-20℃、1.2 mlのアリコートとストアを行う</li></ul><ol><li> （50μg/ ml）を滅菌​​水でPDLを溶かす</li><li>カバーグラスをオートクレーブ、PDLの滅菌水と場所（100カバースリップ用20 ml）ですすいでください。室温で一晩おきます。 </li><li>滅菌水（3広範な洗浄）とPDLを交換してください。その後、4でカバーガラスと店舗℃を乾燥させる</li><li>アストロサイトをメッキ前日、場所6ウェルプレート（バイオサイエンスBDから滅菌蓋、とウェルフラットボトムプレート）上で無菌ウェル中の個々のカバースリップ。各カバースリップ上ラミニンの400μlを入れ、蒸発を避けるために、インキュベーターで、一晩インキュベートする。 </li></ol> 解剖 解剖のメディア： <ul><li> 500ミリリットルアールの平衡塩類溶液（EBSS）（1X）、液体（Invitrogen社、14155〜063） </li><li> 5ミリリットルHEPES溶液（Sigma、H0887） </li></ul> 海馬メディア： <ul><li> 412.5ミリリットル最小必須培地（MEM）（1X）、液体はアールの塩類が含まれていますが、ないL -グルタミンまたはフェノールレッド（Invitrogen社、51200〜038） </li><li> 10 mlのグルコース（Sigma社、D -（+） - グルコース無水物SIGMA ULTRA G7528）MEMで1 M </li><li> 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122） </li><li> 5 mlのピ​​ルビン酸ナトリウム溶液（Sigma社、S8636） </li><li> 12.5ミリリットルHEPES溶液1 M（シグマ、H0887） </li><li> 5ミリリットルN - 2サプリメント（100X）、液体（Invitrogen社、17502〜048） </li><li> 50ミリリットルウマ血清、熱不活化（Invitrogen社、26050〜088） </li></ul> パパインのソリューション： <ul><li>ワーシントンパパイン- 022バイアル（LK003178、最終濃度が20 U / ml）に解剖メディアの5 mlを加え37℃で60分間℃でインキュベートする。 </li></ul><ol><li> P1（通常は2匹）の国内規制及び最寄りの動物実験使用の委員会で吟味し、承認されたガイドラインに従って、老化ラットの仔を刎ねる。 </li><li>コー​​ルド解剖メディアで満たされたペトリ皿で​​皮膚と頭蓋骨と場所の脳を取り外します。 </li><li>髄膜を除去、両半球を細かく分析し、海馬を解剖。 </li><li> 37パパイン溶液中で〜1X1 mmの片とダイジェスト℃で11〜13分間に海馬を切る。 </li><li>組織片が定着したら、慎重にパパイン酵素の痕跡をすべて削除するには、海馬培地5mlを追加削除します。海馬培地（2ml）中のこのステップを再懸濁しますを繰り返します。 </li><li>徐々に小さく穴（1000μmの、〜500μmおよび〜300μm以下）の三火炎研磨ピペットで残って塊が、なくなるまで細胞〜5回をひいて粉にする。 </li><li>一度粉砕し、セルストレーナー（孔径、70ミクロン、BDバイオサイエンス社）を介して細胞を通過する。懸濁液10μlに細胞を数える。 40万細胞/ mlを持つために、海馬のメディアの音量を調整します。 </li><li>カバースリップオフラミニンを吸引し、カバースリップあたりの細胞懸濁液のカバーが乾燥する前に、プレートを200μl。 </li><li>インキュベーター内で60分間添付し、ウェルあたり海馬培地2mlを追加するためにそれらを残す。 </li><li>翌日、死んだ細胞や破片を除去し、予め温めておいた新鮮な海馬培地2mlを追加するには、古い海馬の培地を吸引除去する。 </li></ol> メンテナンス Neurobasalメディア： <ul><li> 500ミリリットルneurobasal（Invitrogen社、12348〜017） </li><li> 10ミリリットルB27の無血清サプリメント（Invitrogen社、17504〜044） </li><li> 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122） </li><li> 1.25ミリリットル、L -グルタミン（Invitrogen社、25030〜149） </li></ul>メッキ後4日から始まる、neurobasal培地でアストロサイトニューロンの培養週に2回通します。温度とCO 2を平衡化するために換気フラスコ内のインキュベーターで30分程度のメディアをPreincubate。 パート2：カルシウムイメージング海馬レコーディングバッファ：110 mMのNaCl、5.4 mMののKCl、1.8 mMのCaCl 2を 、0.8 mMのMgCl 2、10mMのD -グルコース、10mMのHEPES（シグマからすべての化学物質）を用いてpH 7.4（NaOHで調整）。 アストロサイトへのカルシウム指示薬のロード <ol><li> （Invitrogen社、DMSOは2.5μMであるFluo - 4、AM（Invitrogen社、F - 14217）と、0.05％プルロニック® F - 127 20％溶液の入った2ミリリットル海馬記録バッファーを充填した6ウェルプレートにウェルに文化を置きますP - 3000MP）と,10 - 30分間室温でインキュベートする。 </li><li>であるFluo - 4ソリューションを削除し、30分間室温で海馬の記録バッファとインキュベートしてカバーグラスを3回洗浄。 </li><li>チャンバーにカバースリップを置き、レンズクリーニング液でカバースリップの反対側を清掃してください。 </li><li>客観的に液浸オイルの一つの小さな滴（Cargilleから液浸オイルタイプのDFを）入れて、顕微鏡のステージ（オリンパスIX71）にチャンバー（ワーナー音源から25 mmの円形のカバーのオープンチャンバー）を置く。 </li><li>細胞がどのように見えるかを確認し、フォーカスにそれらを得るために透過光を用いて細胞を調べます。その後モノクロから488 nmの（ビジョンTILLからポリクロームV）で細胞を照らすとみたFluo - 4の蛍光シグナルがアストロサイトで均​​一と検出可能であるかどうかを判断する。 </li><li>アストロサイトのカルシウムを測定するために、EPIと全反射照明を使用してください。 </li></ol> 全反射顕微鏡 簡単に言えば、我々は、アンドールIXON DV887DCS EMCCDカメラを搭載したオリンパスIX71顕微鏡を使用してください。励起と画像取得の制御は、TILLVisionのソフトウェアを使用して実現されます。 454/488/515 nmのアルゴン（100 mWの）および442 nmの固体状態（45 MW）レーザのビームを組み合わせて使用​​して制御されるまで、ポリラインレーザーコンバイナ、TIRFデュアルポートのコンデンサーとacoustopticalチューナブルフィルタとコントローラ（AOTF;すべてからフォトニクスTILL）と全反射のコンデンサーに入るためKineflex広帯域光ファイバに供給。我々は、全反射を達成するためにオリンパス60X 1.45 NAのレンズを使用。カメラのゲインは、ノイズ画像に最適な信号を提供するために、それぞれの星状膠細胞に調整されます。背景と全反射顕微鏡の原理は、最近、5日している。我々が使用する光学部品のほとんどは、今アジレントテクノロジー（http://www.till-photonics.com/）の一部であるフォトニクス、TILLから購入した。 TIRの侵入深さは次式から計算することができます。 <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="式" /> D =侵入深さガラスのN1 =屈折率セルのN2 =屈折率発生率の=角発生率のNAI =開口数 レーザーは全反射のために最適に整列されていることを確認するために我々は100nmの蛍光ビーズ（Invitrogen社、F8803）を観察すると便利です。我々は、EPIと全反射顕微鏡でビーズの静止フレームとビデオを提示する。ときに全反射で、一つは信号対雑音の劇的な増加を観察し、ビーズはブラウン拡散が表示されます。我々は最適な全反射ではなく、臨界角に等しいではなかった場合に発生する危険にさらさ斜入射照明ではなく、発生したことを確認するために、定期的に全反射顕微鏡と100 nmのビーズ（〜週1回）の挙動を観察すると便利ですα（図1参照）。 G蛋白質共役型受容体アゴニストのアプリケーション アストロサイトは、代謝型グルタミン酸受容体とP2Y受容体（アゴニスト、ATP、ADP）を含むGQ -共役受容体6,7の様々な表現。これらの受容体の活性化は、星状膠細胞内細胞内カルシウムレベルの大幅な増加につながる。例えば、人は容易にアストロ8-10にATP（30μM）の適用時に細胞内カルシウムの上昇を観察することができます。我々はワーナー音源からのスイッチャーは、VC - 77SPファーストステップ灌流システム（http://www.warneronline.com/index.cfm）と呼ばれる高速なソリューションを使用してください。この方法では解決策は以下〜10ミリ秒未満に適用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> 図1漫画やイメージングの写真は、設定する。 （B）レーザーアセンブリ、コントローラとビームボックスの写真を示すのに対し、A.は、airtableにマウントされている顕微鏡の写真を表示します。 C.は、イメージングのためにマウントされているチャンバーと顕微鏡のステージの写真を表示します。左の高速灌流装置（ステッピングモーターとシータのチューブと一緒に）見ることができます。右上Axopatch 200Aアンプのヘッドステージが見られる。漫画はセット内の光パスをschematizesとどのようにTIRFが達成されます。レーザーは、60X 1.45 NAの対物レンズの後焦点面に焦点を当てて、それが臨界角をαでイマージョンオイルに出てくるようにその位置がセンターをオフに調整されます。この時点で、ビームは、より低い屈折率の媒質中に距離λ（メインテキストの式を参照）で内部全反射と減衰に苦しんでいる。この場合、これはアストロサイトとアストロサイト自身を取り巻く録音バッファです。結果は、形質膜の〜100nmの内の分子の光学的励起（したがって画像）です。細胞内や細胞の上部表面上のものが励起されていないのに対し、細胞の漫画では、これは、緑色の&quot;興奮&quot;膜受容体として示されています。全反射顕微鏡の完全なアカウントはSteyerとAlmers 4で提供されています。 <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="図2" /> 図2。EPIと全反射顕微鏡で取得した100nmの蛍光ビーズの画像。 A.は、数十100nmの蛍光ビーズと視野のEPI画像を表示します。青い矢印は水の拡散であるビーズを指すのに対し、ガラスのカバースリップの上に定住しているビーズに赤い矢印のポイント。このビューではAに示すようにB.は赤い矢印で示される接着ビーズが表示されるビューの同じフィールドの全反射画像を表示します。これらはガラスのcoverlsipに定住し、〜100nmのエバネッセント場内でこのようにしたしていたためです。青色の矢印でに示されているビーズは、この領域内にないため、全反射の画像では見えません。下のプロットは、画像の3Dレンダリングを示しています。それは、全反射顕微鏡で観察すると、信号対ノイズの大幅な増加は、エバネッセント場内のビーズのために起こることは明らかである。全反射のためにそれが20であったのに対し± 0.7実際にはこれらのイメージのためにEPIのための信号対雑音比は、7.1 ± 0.6であった。 <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="図3" /> 図3。EPIと全反射顕微鏡で取得したフルオ-4カルシウム指示薬を搭載したアストロサイトの画像。 fiveアストロサイトとビューのフィールドのA. EPI画像。 AとBのイメージが大きく異なることをBに示すように、B.ビューの同じフィールドの全反射像は注意してください。 TIRF照明とガラスのカバースリップに近い同格でのみ細胞膜領域がイメージングされているためです。下のパネルでは、EPIと全反射顕微鏡で撮像ATP誘発細胞内カルシウムトランジェントを示しています。

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	<li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats.">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li><li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane.">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes.">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li><li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons.">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li><li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIA:+listening+and+talking+to+the+synapse.">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks.">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li><li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes.">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li><li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li><li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors.">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li><li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons.">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li><li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li></ol>

それは、アストロサイトは細胞内カルシウムの上昇を表示することが十分に確立されている。これらは自発的に発生する、アストロサイト表面11上の受容体を活性化するニューロンの活動によって、またはアゴニストのアプリケーションによってトリガーすることができます。一つの重要なと論争はアストロサイト細胞内カルシウムの上昇が神経細胞11、12に受容体を活性化するシグナル伝達...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Micro Cover Slips, Round, No. 1</td><td>Tool</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle&amp;rsquo;s salts, but no L-glutamine or phenol red</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin liquid</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution 1 M</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), liquid</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, Heat-Inactivated</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reagent</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Medium (1X) Liquid without Phenol Red</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers</td><td>Tool</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile</td><td>Tool</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrate</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrate</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES free acid</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20% solution in DMSO</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil TYPE DF</td><td>Microscope</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 &amp;mu;l volume</td><td>Tool</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater</td><td>Tool</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &amp;mu;m, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes

脳は、グリア細胞が含まれています。アストロサイト、グリア細胞の種類は、神経細胞に受動的な支援する役割を提供するために長い間知られている。しかし、増加する証拠は、アストロサイトはまた、積極的に神経細胞との機能的な相互作用を介して脳機能に関与する可能性を示唆している。しかし、アストロサイト生物学の多くの基本的な側面は、議論の不明確及び/または実験的に未踏のまま。重要な問題の1つは、アストロサイトにおける細胞内カルシウムトランジェントのダイナミクスである。カルシウムが十分に重要なセカンドメッセンジャーとして確立されているため、それがアストロサイトのカルシウムの上昇は、アストロサイトからの伝達物質の遊離を引き起こすことができることが提案されているので、これは関連しています。しかし、アストロサイトのシグナル伝達の近くに、細胞膜のカルシウムの任意の詳細や満足な説明がされていません。全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、生きた細胞の原形質膜の約100nm内で生理学的に関連するシグナル伝達事象を分析するための強力なツールです。ここでは、全反射顕微鏡を使用し、ほぼ同時に形質膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くに監視する方法について説明します。このアプローチのさらなる改良と体系的なアプリケーションは、アストロサイトのカルシウムシグナル伝達の正確な詳細をお知らせする可能性があります。アストロサイトのカルシウム動態の詳細な理解は、次の場合に、どのように、いつ、なぜアストロサイトとニューロンはカルシウム依存性の機能的相互作用を受ける理解する基礎を提供することがあります。

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K ビュー.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. 我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

神経科学

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

イメージング細胞内Ca<sup&gt; 2+</sup遺伝的にエンコードされたカルシウム指標を用いて成体マウスからの線条体アスト​​ロサイト&gt;シグナル

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

要約

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急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

イメージング細胞内Ca

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロサイトのように

膜をターゲットとした Ca^{2 +}インジケーターによる培養細胞のローカル Ca^{2 +}シグナルの解剖

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

遺伝子組み換え^Ca2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリア^Ca2+ 取り込み

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

要約

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急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

イメージング細胞内Ca

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロサイトのように

膜をターゲットとした Ca^{2 +}インジケーターによる培養細胞のローカル Ca^{2 +}シグナルの解剖

遺伝子組み換え^Ca2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリア^Ca2+ 取り込み

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution