このプロトコルは、健康および疾患における各細胞型応答を特徴付ける細胞間カルシウムシグナル伝達パターンを明らかにすることを可能にする。この技術により、複雑な細胞挙動の迅速かつ詳細な生物物理学的特性評価が可能になります。このIgG誘導カルシウムシグナル伝達を、神経炎症性疾患の個別化医療の指紋として使用する予定です。
実際の設定では、すべてのプロセスとイベント、特に顕微鏡下で発生するプロセスとイベントを見て追跡することは容易ではありません。したがって、ビジュアルデータは重要です。生後1〜3日の子犬を斬首した後、小さな角度の付いたハサミを使用して皮膚を切り開いて頭蓋骨を露出させます。
次に、大孔を軌道に向かって切断して頭蓋骨を開き、垂直正中線を切ります。頭蓋骨から脳を取り除き、PBSを含むペトリ皿に入れます。鉗子の先端を使用して両方の半球間の接続を引き裂き、半球を中央から横にそっと押して、湾曲した鉗子で半球を分離します。
まっすぐで湾曲した鉗子を使用して、髄膜を慎重に引き裂いて取り除きます。次に、湾曲した鉗子で海馬をつまんで取り外し、廃棄するか、別の細胞培養準備に使用します。次に、3ミリリットルの冷たいPBSを含む15ミリリットルのチューブに皮質を移し、1ミリリットルの先端で10〜15回上下にピペッティングして組織を均質化します。
細胞を500 gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、1ミリリットルのチップでピペッティングすることにより、ペレットを3ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。もう一度遠心分離し、10%FBSおよび抗生物質を添加した2ミリリットルの完全DMEMにペレットを再懸濁した。
ホモジネートを2ミリリットルのチューブに移した後、ホモジネートを21ゲージおよび23ゲージの針に通して、単一細胞の懸濁液を作ります。1つの皮質から調製した細胞懸濁液を3ミリリットルの完全DMEMを含む60ミリメートルのペトリ皿に注ぎ、懸濁液が均一に分布するようにペトリ皿を軽く振る。5%二酸化炭素と95%空気を含む加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。
星状細胞の増殖を促進するには、古い培地を取り除き、予熱したPBSで細胞を洗浄して、70〜80%のコンフルエントに達したら、緩く付着したグリア細胞と微量のFBSを取り除きます。次に、1ミリリットルの予熱したトリプシン溶液を加えて星状細胞の下層をトリプシン処理し、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。顕微鏡を使用して細胞が剥離し始めるかどうかを確認し、4ミリリットルの完全なDMEMを追加します。
細胞懸濁液を集め、それを15ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを500 gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの完全培地に再懸濁します。
血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、培養皿を準備し、培地を追加します。5ミリリットルの新鮮な完全DMEMに1平方センチメートルあたり10〜4セルの密度で細胞を再プレートし、各培地交換の前に完全なDMEMで細胞を洗浄します。
70〜80%のコンフルエントに達した後、トリプシン処理を繰り返し、7ミリメートルのポリL-リジンコーティングされた円形ガラスカバースリップ上に3番目の星状細胞に10回5回播種します。10分間取り付けて、完全なDMEMを追加します。48時間後の実験でそれらを使用してください。
ミクログリア培養を準備した後、ミクログリアを促進するために、グリア細胞がコンフルエントになるのを許し、ミクログリアは10〜15日後に星状細胞層の上に現れる。ペトリ皿をオービタルシェーカーで220RPMで2時間振とうします。次に、1ミリリットルのピペットチップで上清を吸引することにより、剥離して緩く付着した細胞を軽く洗浄します。
上清を細胞の層に数回静かに分注し、この洗浄ステップ中に細胞層の表面全体を覆うようにします。剥離した細胞を含む培地を収集し、15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離、再懸濁、および前述のように細胞をカウントします。
7ミリメートルのポリL-リジンコーティングされた円形ガラスカバースリップに10〜3番目のミクログリアを5回播種します。10分間取り付けて、完全なDMEMを追加します。48時間後の実験でそれらを使用してください。
完全なDMEMを洗い流すには、1つのカバースリップを細胞外溶液の入った皿に移します。1ミリモルのFluo-4 AMを細胞外溶液で希釈して色素負荷溶液を調製し、最終濃度5マイクロモルを達成します。色素担持溶液に細胞の入ったカバースリップを室温暗所で30分間置き、細胞外溶液で20分間細胞を洗浄する。
カバースリップを1ミリリットルの作業溶液と一緒に記録室に置きます。実験全体を通して一貫した数の細胞を有する視野を選択する。イメージングを開始し、3〜5分間蛍光の基礎レベルを取得してベースラインを決定します。
次に、作業溶液の流れを停止し、目的の時間だけテスト溶液に切り替えます。各試験溶液の間で、作業溶液の一定の流れで3〜5分間細胞を洗浄する。溶液の上部から一定の吸引を配置することにより、記録チャンバー内の溶液容量を1ミリリットルに保ちます。
最も高い信号強度のフレームを選択し、ポリゴンツールアプリケーションを使用して1つのセルを囲みます。取得したフィールド内のすべてのセルを囲んだ後、円ツールを使用して背景の5つの関心領域を選択します。次に、単一セルの平均信号強度と各時間枠の背景を測定します。
関心のあるすべての領域を選択し、ImageJのROIマネージャーのマルチメジャーコマンド、または商用ソフトウェアの同等のコマンドを使用します。MATLABソフトウェアでデータをインポートした後、5つのバックグラウンドROIを平均し、同時に取得したフレームの平均ROI強度から各フレームの平均バックグラウンドを差し引きます。その後、カルシウムピークの振幅、カルシウム過渡の積分変化、ピークまでの時間、立ち上がり時間、半値幅、および周波数を決定することにより、カルシウム活性を分析します。
GFAPはアストロサイトを可視化するために使用され、Iba1はミクログリアを可視化するために使用されます。hSOD1G93Aアストロサイトは、非トランスジェニックアストロサイトよりもカルシウム一過性の振幅が大きく、全体的な統合変化が大きく、ピークまでの時間が短いALS免疫グロブリンGに応答します。ALS免疫グロブリンGに対する応答は、ATPに対する応答と区別可能である。
hSOD1G93A星状細胞は、貯蔵庫の枯渇によって明らかにされたように、貯蔵中のカルシウムイオンのレベルが高く、このイオンの過負荷を示しています。ミクログリアを培養し、平均蛍光強度を経時的に抽出した。3つの細胞のカルシウムトレースは、1つの細胞のみがALS免疫グロブリンGに応答し、すべての細胞がATPに応答したことを表しています。
擬似カラー画像は、ALS、IgG、およびATPに応答した蛍光強度およびベースラインを表した。実験中にシグナルが分離されないように、細胞に十分な負荷をかけ、イメージングシステムのパラメータを適切に調整する必要があります。カルシウム放出に加えて、パッチクランプを行うことができます。
したがって、異なる膜イオン電流とカルシウム放出との間の相関のより完全な全体像を得ることができる。細胞内カルシウム恒常性の理解は、自然刺激およびストレス刺激および外部刺激に対するいくつかの応答の探索にとって非常に重要です。
