パーキンソン病を研究するための化学物質、タンパク質、またはウイルスベクターの頭蓋内定位送達

定位固定装置フレームを使用して、げっ歯類の特定の脳領域に溶液をうまく注入する方法について説明します。このサバイバル手術は、パーキンソン病のさまざまな側面を模倣するために使用される確立された方法です。

パーキンソン病(PD)は、主に黒質のドーパミン作動性ニューロンの喪失により、安静時振戦と無動症によって伝統的に定義される進行性の障害です。罹患した脳領域は、主にα-シヌクレイン(asyn)タンパク質からなるニューロン内線維封入体を示します。これまでのところ、この疾患のすべての特徴を再現した動物モデルはありませんでした。ここでは、PDのさまざまな側面を模倣するために、脳定位固定装置注射を使用して化学物質、タンパク質、またはウイルスベクターを頭蓋内に送達する方法について説明します。これらの方法は確立されており、PD分野全体で広く使用されています。脳定位注射は非常に柔軟です。それらは、濃度、注射に使用される動物の年齢、対象となる脳領域、および使用される動物種で調整することができます。物質の組み合わせにより、治療を評価したり、病状の重症度や行動障害を変更したりするための迅速なバリエーションが可能になります。脳に毒素を注入することにより、炎症やドーパミン作動性ニューロンの深刻な喪失を模倣することができ、その結果、かなりの運動表現型が得られます。ウイルスベクターは、遺伝的または機構的な側面を模倣するために細胞を形質導入するために使用できます。事前に形成された線維性無糖注射は、長期間にわたって進行性の表現型を最もよく再現します。これらの方法が確立されると、新しいトランスジェニック系統を作成するよりも、新しいモデルを生成する方が経済的です。ただし、この方法は、使用するモデルにもよりますが、動物ごとに30分から4時間かかるため、労働集約的です。各動物はわずかに異なるターゲティングを持つため、多様なコホートが作成され、一方では結果を解釈するのが難しい場合があります。一方、患者に見られるより現実的な多様性を模倣するのに役立ちます。誤って標的化された動物は、行動または画像の読み取り値を使用して、または屠殺された後にのみ特定でき、研究がすでに終了した後にコホートサイズが小さくなります。全体として、この方法は、PDの多様な側面を評価するための初歩的ですが効果的な方法です。

パーキンソン病(PD)は、60歳以上の人々の最大1%が罹患する比較的一般的な進行性神経変性疾患^です1。PDは不均一ですが、臨床的には主に安静時振戦、運動緩慢、無動症、硬直、歩行障害、姿勢不安定などの運動症状を特徴としています。運動症状の大部分は、通常、線条体ドーパミン(DA)の60〜70%が黒質(SN)の進行性で明確な神経変性の結果として失われたときに現れます^2,3。生き残ったドーパミン作動性ニューロンには、レビー小体⁴として知られる細胞内封入体が含まれています。これらの凝集体は主に、脳内のニューロンに小さくても高度に発現するタンパク質であるα-シヌクレイン(asyn)で構成されています⁵。

PDにおける神経変性の根本的なメカニズムはまだ不明です。老化は依然としてこの障害の最大の危険因子です⁶。さらに、PDを自然に発症するのは人間だけです。そこで、PDの病態調査や疾患進行予防のための新薬の試験を行うために、さまざまな動物モデルが開発されてきた⁷。理想的には、PDの動物モデルは、SNのDAニューロンの年齢依存性の進行性の喪失を示し、細胞内封入体とそれに続く運動機能障害を示し、DA補充療法に反応するべきです。現在利用可能な動物モデルはいずれも、PDのすべての臨床症状と病理を完全に再現するものではありません。各モデルは疾患の異なる側面を示しているため、尋ねられた質問に基づいて、実験で使用する適切なモデルを慎重に検討することが重要です。

歴史的に、動物モデルは、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)や1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)などの毒物や、ロテノンやパラコート^などの農薬に基づいていました8。各毒物には異なる作用機序があり、DAニューロンに特異的なものから一般的に脳細胞に有害なものまでさまざまです。毒素は、経口投与するか、腹腔内に注射するか、血液脳関門の透過性に応じて定位注射を使用して脳に直接投与することができます。他のモデルとは異なり、毒素モデルは高度の黒質線条体ドーパミン作動性細胞の損失と行動表現型を保証します。一部のモデルは、微妙な病状を示すことさえあります。これらの特徴により、毒素PDモデルは、補充療法や^PD9,10の発症に対する環境毒素の影響を研究するための優れたツールとなっています。

さらに、種々のプロモーターおよびPD関連遺伝子¹¹を用いて、多数のトランスジェニックマウスモデルが作製されている。ほとんどのマウスは黒質線条体の病状を呈しますが、神経変性の明確な証拠はありません。トランスジェニックモデルには、動物とコホート間で一貫性があり、一度生成されると維持と配布が容易であるという利点があります。それらは神経変性をもたらさないが、それでも、複合体in vivoシステムにおける遺伝的変異および可能性のある薬剤候補によって引き起こされる細胞変化を研究するための有用なモデルである¹²。

トランスジェニックモデルとは対照的に、PD関連遺伝子のウイルスベクター媒介発現は、より柔軟なアプローチを提供します¹³。定位固定装置注射は、マウス、ラット、ブタ、ヒト以外の霊長類など、幅広い動物種に対して、さまざまな脳領域、細胞型、発現レベルを選択することを可能にします。最初に、asynをコードする組換えウイルスベクターを使用して、ラットSNに位置するニューロンを形質導入しました。タンパク質の蓄積と細胞機能障害は、進行性のドーパミン作動性細胞の喪失に先行し、行動障害を引き起こします。ターゲティングの違いは、動物間の細胞損失の大きな変動(30〜80%)につながる可能性があり、これは注射されたラットの約25%にしか見られない変動行動障害の原因です¹⁴。

最近確立されたモデルは、マウスまたは患者の脳組織^15,16からの予め形成されたasyn線維(PFF)または凝集抽出物の頭蓋内注射である。複数の研究により、PFFまたは抽出物の注射は、動物の脳に広範な無症候群の病理をもたらし、SNのドーパミン作動性ニューロンの喪失をもたらすことが示されています。アシンの蓄積は、注入された領域を神経支配するニューロン内に現れます。ウイルスベクターベースのモデルとは異なり、PFFモデルは数か月にわたってゆっくりと進行し、6か月で運動障害が発生します。このモデルは、無症候性病理^学17,18のメカニズムまたは予防を研究するための大きな可能性を秘めています。

上記のすべてのモデルは十分に確立されており、人間の障害のさまざまな側面を研究するために何度も使用されています。脳に直接物質を定位注射することは、PDの分野だけでなく、他の神経疾患においても、これらの動物モデルの開発に大きな役割を果たしてきました。定位固定装置手術は、手間がかかりますが、使用する動物の年齢、標的とする脳領域、注入する物質の柔軟性が高いという利点があり、研究課題に応じて調整することができます。例えば、物質は、単独でまたは組み合わせて(ベクター+フィブリルまたは毒物+ベクター)注射して、疾患のより多くの側面を再現したり、治療を評価したりすることができる^19,20。さらに、物質を一方的に注入することができ、注入されていない側を内部制御として残し、行動や神経変性を評価することができます。したがって、この原稿では、定位固定剤注射を使用してPDモデルを生成するための詳細な手順を概説します。

この研究におけるすべての実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施され、米国国立老化研究所の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

開始する前に、この手順を実行するために必要な適切なトレーニングと倫理的承認を所属機関から取得していることを確認してください。さらに、使用する麻酔薬(ケタミンとブプレノルフィン、またはフェンタニルとメデトミジンなど)は、所属機関の関連規則に従って取得および取り扱う必要があります。

1. 準備(所要時間1時間)

1. 動物を手術室に連れて行き、手術エリアを設定しながら順応させます。適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。
   注:これは、地域の安全規制と注入される物質に依存する場合があります。ウイルスベクターは、ほとんどの場合、バイオセーフティーレベル2のPPEが必要です。一般的に、少なくともマスク、手袋、使い捨ての白衣を着用してください。特定の状況では、追加の手袋とゴーグルを使用する必要があります。
2. オートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器を使用して手術器具を滅菌します。げっ歯類には、メスのハンドル、止血鉗子、デュモンピンセット、湾曲した鉗子、創傷閉鎖キット(クリップ)またはハサミと鉗子(縫合糸用)、ドリルヘッドが必要です。
3. 手術部位と脳定位固定装置を70%エタノールで消毒し、脳定位固定装置の隣の領域を清潔なペーパータオルまたは滅菌吸収シートで覆います。
4. タオルの上に以下を置きます:点眼薬(例:リキゲル)、ヘアトリマー、綿棒、希釈されたヨージキサノール、使い捨ての外科用ブレード、消毒されたドリルビット、マーカーまたは耳切り、滅菌されたドリルビット、マーカーまたは耳切り、1.5 mLチューブに滅菌H₂O、滅菌H₂Oに3%H₂O₂を含む1.5 mLチューブ(1.35 mLのH₂O + 0.15 mLの30%H₂O_2、 作りたて)、33G 針と滅菌 PBS または生理食塩水を含む 1 mL 注射器、注射麻酔を使用する場合は鎮痛剤と解毒剤が入った注射器 (例: アチパメゾール + ブプレノルフィン/ケトプロフェン; 新たに調製され、倫理的許可で承認されています) およびオートクレーブ滅菌された手術器具。
5. イソフルランを充填し、ガス麻酔を使用している場合はO₂ およびN₂ 圧力を確認します。吸入チャンバーの底にペーパータオルを追加して、吸入チャンバーを乾燥させて清潔に保ちます。
   麻酔薬(例:フェンタニル+メデトミジン(ラット用)またはケタミン+キシラジン溶液(マウス用))を混合して新たに調製します注射可能な麻酔を使用し、倫理的許可で承認されている場合は。
6. ハミルトンガラスシリンジとガラスキャピラリーを組み立てます(図1A1。
   1. 引っ張ったガラスキャピラリーをテーブルに置きます。人差し指を毛細血管が細くなる場所に置いて、毛細血管を切断するべき場所に爪の端を置きます。
      注:注入の深さにもよりますが、0.5〜2cmの範囲で行います。
   2. セラミックタイルの端を使用して、針の部分を数回慎重に引っ掻きます。ガラスキャピラリーを片手に取り、親指と人差し指で細い針の部分をつかみます。針が鈍く折れるまで、真ん中から端まで引っ張ります。
      注意: それが機能しない場合、または針が端から折れる場合は、数回繰り返します。それでも折れない場合は、タイルの引っ掻き傷を繰り返します。針の部分が細すぎず(直径>50μm)、曲がりにくいことを確認してください。
7. ガラスキャピラリーをハミルトンシリンジに密封します。.
   1. ハミルトンガラスシリンジに取り付けられた鈍い金属針に1cmのシュリンクチューブを取り付けます。次に、ガラスキャピラリーの太い端をハミルトンの金属針の上に置きます。
   2. ガラスキャピラリーの半分以上にシュリンクチューブを配置し、ハミルトン金属針の端とキャピラリーの円錐形の遷移部との間に少なくとも1cmのスペースを確保します。これは、後で目的の注射可能な溶液を保持するスペースになります。
   3. ライターまたはマッチを使用してシュリンクチューブを加熱し、注射針を密封します。
      注意: ハミルトンシリンジを左側の定位固定アームに固定するためのいくつかの異なるホルダーオプションがあります。ハミルトンのシリンジの数字がまだ読めることを確認してください。ポンプを使用して溶液を注入する場合は、ポンプを脳定位固定装置アームに取り付け、ハミルトンシリンジをポンプに固定します。
8. 金属製のプランジャーを取り外します。生理食塩水またはPBSを充填した1mLシリンジに取り付けた27Gの針をハミルトンシリンジの上部に挿入します。ハミルトンシリンジをPBSで洗い流して、密封されているかどうかを確認し、すべての気泡を洗い流します。
   注:気泡は、空気が液体よりも圧縮されるため、溶液の取り込みと注入を妨げます。
9. すべてのチェックが完了して準備ができたら、脳定位固定装置のz軸アーム(図1A 2.)の小さなネジを開き、アームを時計回りに90°ずつ回転させてガラス製シリンジ/キャピラリーを邪魔にならないように動かします(動物を定位固定装置に固定する際にキャピラリーが壊れないようにするため)。
   注意: すべてのステレオタックス角度と設定が目的のパラメーター(通常は0°)に設定されていること、トゥースバーとイヤバーが目的の座標に設定されていること、およびハミルトンシリンジ/キャピラリーがすべてまっすぐであることを確認してください。
10. ステレオタックスプラットフォームのヒートパッドをオンにし、暖かすぎる場合は上部に追加のパッドを使用します。手術エリアの隣に追加のヒートパッドが付いた空の清潔なケージを置きます。

2.手術(所要時間は1匹あたり平均1時間)

1. ガス麻酔用
   1. N₂ + O₂ 空気の流れ(約1 L / min)でイソフルランを5%にオンにし、バルブを吸入チャンバーに開きます。動物をチャンバーに入れ、しっかりと密閉されていることを確認します。呼吸がかなり遅くなるまで呼吸を観察します(深呼吸)。
   2. 動物が意識を失ったら、固定装置の弁を開き、チャンバー弁を閉じます。イソフルランを2%に設定します。
   3. チャンバーを開き、首に保持している動物を取り出し、鉗子で口を開き、動物を歯のバー(図1A6)に置きます(図1A6.)前歯を穴にはめ込みます。
      注:このステップは、動物がイソフルランを吸い込まないことで再び目を覚ます可能性があるため、時間に敏感です。
   4. ノーズコーンを鼻の上に置き、呼吸を観察して、無理に呼吸せずに一定のリズムを確保します。先に進む前に、後肢のペダル離脱反射がないことを確認して、動物が深く麻酔されていることを確認してください。
      注:動物が呼吸を止めたり目を覚ましたりしないように、手順全体を通して確認し続けてください。必要に応じて、イソフルランの%を少しずつ調整します。.後肢のペダル離脱反射をテストするには、ピンセットを使用して後足をつまみます。動物が手足を引っ込める場合(痛みの刺激から取り除く反射)、麻酔が低すぎます。
   5. 2つのイヤーバーを使用して動物の頭を所定の位置に固定します(図1A7)。正しく行われると、耳はイヤーバーの上に横向きになっているはずです。頭がまだ動いている場合は、イヤーバーまたはノーズコーンを調整して、頭を所定の位置にしっかりと固定します。
      注意: イヤーバーを深く挿入しすぎて動物の鼓膜を壊さないように、優しくしてください。ラットは、イヤーバーが正しく挿入されていると点滅する傾向があります。
2. 注射麻酔の場合:
   1. 動物に適切/推奨用量の麻酔I.P.(ラットの場合は300μg/kgのフェンタニルと300μg/kgのメデトミジン、マウスの場合は100mg/kgのケタミンと10mg/kgのキシラジン)を注射し、ホームケージに戻します。
   2. 注射の5分後に動物のペダル離脱反射を確認します。存在しない場合は、2つのイヤーバーを使用して動物の頭を所定の位置に固定します(図1A、7)。正しく行われると、耳はイヤーバーの上に横向きになっているはずです。その後、動物を歯バー(図1A6)に置き、レバーをねじ込みます。ヘッドがまだ動いている場合は、イヤーバーまたはレバーコーンを調整して、ヘッドを所定の位置にしっかりと固定します。
      注意: イヤーバーが深すぎると、動物の鼓膜が壊れる可能性があります。レバーをきつく締めすぎないでください。動物の鼻を折る可能性があります。
   3. ペダル離脱反射が観察された場合は、さらに5〜10分待ちます。それでも観察される場合は、前の麻酔薬のさらに10%を注射します。.
      注:窒息による動物の死を避けるために、待機期間を挟んで麻酔薬の投与量をゆっくりと増やしてください。
   4. 歯のバーやイヤーバーの高さを調整して、頭蓋骨が平らであることを確認してください。
      注意: バーを調整するときは、ヘッドの角度が変わり、ノーズコーン/レバーが動物の鼻を壊す可能性があるため、注意してください。
3. 各目(リキゲルなど)に点眼薬を塗り、手術中の乾燥を防ぎます。.動物の頭を目から耳まで剃ります。
4. 10%ヨードポビドンを使用して手術部位を消毒します。さらに、局所麻酔薬(例:.、0.5%リドカイン)を切開部位に皮内注射します。.続行する前に、動作するために2〜3分待つことをお勧めします。
5. メスを使用して、目の間から耳の間まで1回連続して切開します。
   注:首の筋肉を切ると回復が難しくなるため、後ろに切りすぎないように注意してください。
6. 綿の先端を使用して傷口を開き、血液からその部分をきれいにします。ラットの場合は、止血鉗子を使用して、皮下組織に固定し、両側に垂らすことにより、創傷を開いたままにします。マウスの場合は、必要に応じてマイクロクリップを使用してください。
   注:これは手順の最も苦痛な部分です。皮膚ではなく皮下組織をクランプすると、治癒が促進されます。
7. シリンジ/キャピラリー(図1A1.)をz軸上で反時計回りに180°動かし(図1A2.)、動物の頭の上に持ってきます。手術中にz軸アームがぐらつかないように、ノブを完全に閉じてください。
8. 顕微鏡と各脳定位固定アームのノブ(図1A、3.-5)、ガラスキャピラリー(ハミルトンガラスシリンジに取り付けられている)の鈍い端を動かします。図1A、1。ブレグマの真上(骨に触れるが、骨を押さない)。デジタルディスプレイ上のすべての値をゼロに設定します(図1A、8)。
   注:ブレグマ(図1B)は、頭頂骨と前頭骨の矢状縫合糸と冠状縫合糸が交わる点です。これが原点になります。
9. 顕微鏡を覗いて、キャピラリーの鈍い端をラムダの真上に動かします。z軸(背側/腹側= DV)の値が+/- 0.1 mm以内の場合、動物の頭は水平になります。それが高いか低い場合は、歯のバーを使用して、+/- 0.1mm以内になるまでそれに応じてヘッドを調整します。
   注:ラムダ(図1B)は、頭頂骨と後頭骨の矢状縫合糸と冠状縫合糸が交わる点として定義されます。この方法は、イヤーバーを個別に調整できる場合、頭蓋骨の左側と右側を水平にするためにも使用できます。バーを調整するときは、ヘッドの角度が変わり、ノーズコーン/レバーが動物の鼻を壊す可能性があるため、注意してください。
10. Allen脳アトラス(図1C、D)を使用して、目的のターゲット領域の座標を特定します。y軸(前/後= AP)とx軸(内側/外側= ML)のアームを使用して、シリンジ/キャピラリーを正しい位置に移動します。
    注:染料注射(図2A-E)は、使用する動物の系統/年齢に対して座標が正しいことを確認するために、別々の動物で外科的処置を行う前に行う必要があります。
11. 顕微鏡を覗き込み、毛細血管の鈍い端が骨と出会う場所に慎重に穴を開ける準備をします。開始する前に、キャピラリーをy軸上で十分に上に動かして、穴あけ中にキャピラリーが損傷しないようにします。大きな円で穴を開け始め、深く穴を開けるにつれて小さくなります。穴を開けるときは、手をイヤーバーに置いて安定させます。
    注意: 脳組織までドリルで穴を開けないでください。硬膜への損傷を避けるために、骨の薄い層を残します。代わりに、ピンセットを使用して、残りの薄い骨の層を慎重に取り除きます。
12. 顕微鏡を使用して、針の鈍い端が骨片によって迂回されることなく硬膜/脳組織に触れることができることを確認します。
13. 注射液の汚染を避けるために、シリンジ/キャピラリーを清掃してください。
    1. シリンジ/キャピラリーを完全に上に動かし、3% H₂O₂ を含む 1.5 mL チューブに浸します。ガラスからすべての破片や血を取り除いてください。次に、キャピラリーを_H2Oを含む1.5mLチューブに浸して_H2O2を洗い流します。
    2. ハミルトンシリンジから金属製のプランジャーを取り外し、動物の頭の上にあるシリンジ/キャピラリーの下にガーゼを置きます。PBSを充填した1mLシリンジを使用して、ハミルトンシリンジを上部に挿入し、PBSを噴出してハミルトンシリンジを洗浄します。この後、金属製のプランジャーをハミルトンシリンジに挿入します。
14. 1μLの空気を吸い上げます。これにより、ハミルトンシリンジ内のPBSと注入液がキャピラリーで混ざるのを防ぎます。次に、必要な量の注入液を吸い上げます。1回の沈着物につき最大1 μLおよび2 μLが、マウスおよびラットにそれぞれ推奨されます。
    注:脳内の圧力が過度に上昇するため、半球あたり合計3μL /6μLを超えないようにしてください。ペンを使用して、溶液の半月板がどこにあるかに非常に注意深く小さな印を付けることができます。このマークは、溶液が脳に入るかどうかを測定するための基準点として使用できます。
15. ラットの場合は、25Gの針を使用して硬膜に穴を開けます。毛細血管を脳に挿入し、目的のDV座標にします。シリンジ/キャピラリーを意図したよりも0.1 mm深く動かし、引き戻して溶液用のスペースを確保します。.
16. 溶液を手で注入するか(10〜15秒あたり0.1μL)、またはポンプで(0.4〜0.6μL / min)注入します。メニスカスをチェックして、溶液が完全に注入されていることを確認します。
    注:溶液が脳に移動しない場合は、シリンジ/キャピラリーを0.2mm上下に動かします。それでも注入されない場合は、 手順2.13〜2.14を繰り返します。おそらく針は脳組織の破片で詰まっています。
17. シリンジ/キャピラリーをさらに5分間所定の位置に保持して、注入された溶液が分散し、圧力が下がるようにします。この待機期間中に、鎮痛剤を注射し、必要に応じて動物に印を付けます。
18. シリンジ/キャピラリーを0.2 mm上に動かし、さらに2分間所定の位置に保持します。シリンジ/針を非常にゆっくりと引き出して、負圧による注入液の引き上げを防ぎます。
19. シリンジ/キャピラリーが脳から出たら、 ステップ2.13 の説明に従って洗浄し、組織が乾燥してキャピラリーを詰まらせるのを防ぎます。
20. より多くの脳領域を注入し続けるか、手術を完了してください。
21. シリンジ針をz軸上で180°回転させて脇に動かし、傷口を閉じる際の破損を防ぎます。次に、クリップ、ティッシュ接着剤、または縫合糸のいずれかで傷を閉じます。注射麻酔を使用した場合は、解毒剤を動物に注射します。
    注:一人で飼育されていない動物は、お互いの頭を掃除し、クリップ、接着剤、ステッチを取り除く傾向があります。
22. 動物を脳定位固定装置フレームから取り外し、ヒートパッドの上にある清潔なケージに入れます。動物を監視して、合併症なく目を覚ますことを確認します。最初の24時間は、食料と水に簡単にアクセスできるようにします。

3. 術後ケア(期間3-7日)

1. 適切な回復を確実にするために、次の2〜3日間(毒物注射の場合は最大10日間)に動物の体重(10%の減量が許容されます)、毛皮、糞便、食物/水の摂取量を確認してください。必要に応じて、動物を隔離し、ウェットフード、生理食塩水注射、および動物が追加の全身問題を抱えている可能性があるため、一部の毒物注射に不可欠な加熱パッドを提供します。
2. 手術後さらに1〜2日間動物に鎮痛剤を注射し、地域の規制に従って痛みの緩和を確保します。縫合糸、クリップ、または接着剤が自然に剥がれない場合は、イソフルランを使用して動物に麻酔をかけ、術後1週間で縫合糸、クリップ、または接着剤を取り除きます。

ミスターゲティングを避けるため、毎回の実験の前に、色素注入を使用して座標を確認してください。動物に同じプロトコルを使用して0.2〜0.5μLのトリプトファンブルーを注射し、注射後に毛細血管を急速に引き抜き、拡散を避けるために脳を急速に凍結しました。ミクロトームで切片を作製した後、注入部位は青色で見えます(図2C、E

脳定位固定装置注射は、他の外科的処置と同様に、動物の健康と生存を保証することが主な困難である。したがって、手順全体を通して動物を注意深く監視することが不可欠です。呼吸の不規則性、呼吸の喪失、反射神経や動きの再発に注意することは、特に経験の浅い外科医にとって、主な焦点となるべきです。さらに、鎮痛剤の適用は、回復プロセスを支援する...

著者は何も開示していません。

この研究は、国立老化研究所の国立衛生研究所の学内研究プログラムによって部分的に支援されました。CES は NS099416 でサポートされています。著者らは、NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952 and MH002952 to Yogita Chudasama) と NICHD IRP Microscopy and Imaging Core によるサポートに感謝したいと思います。