La nostra ricerca cerca di comprendere i meccanismi immunitari alla base della patogenesi della fibrosi polmonare. Una delle maggiori sfide nel campo rimane la traduzione di modelli in vitro e in vivo in fibrosi polmonare umana. Esistono numerosi modelli animali per studiare la fibrosi polmonare.
Cerchiamo di standardizzare uno dei modelli più comunemente usati, il modello murino della bleomicina, in modo che sia facilmente adattabile per l'uso da parte di altri laboratori. Presentiamo un metodo minimamente invasivo, altamente riproducibile e sicuro per somministrare la bleomicina nel modello murino di fibrosi polmonare. Questo modello animale si integra in vitro negli studi sull'uomo.
Comporta l'esecuzione dei tipi di cellule critici per la patogenesi e replica fisiologicamente i cambiamenti nella ventilazione, nella perfusione e nello scambio di gas che si verificano durante la lesione. Prevediamo che gli interventi che riducono gravemente la gravità istopatologica in vivo possano indicare migliori risultati clinici. Procedere alla preparazione di soluzioni di bleomicina in una cappa chimica seguendo le adeguate precauzioni chemioterapiche.
Per prima cosa sciogliere la polvere di bleomicina in PBS sterile per preparare una concentrazione madre di 10 unità per millilitro. A seconda della bleomicina specifica utilizzata e dell'obiettivo sperimentale, preparare la concentrazione di lavoro finale secondo la dose richiesta in base al peso corporeo. Per regolare il volume finale di somministrazione, diluire la bleomicina a 0,375 unità per millilitro, garantendo un volume totale di 50 millilitri per un topo da 25 grammi.
Sospendi il topo adeguatamente anestetizzato sulla piattaforma procedurale con un angolo compreso tra 60 e 80 gradi appendendolo per gli incisivi anteriori per aprire efficacemente l'orofaringe. Occludi il passaggio nasale utilizzando un morsetto microvascolare liscio per forzare la respirazione attraverso l'orofaringe. Usando una pinza, ritrarre la lingua fuori dall'orofaringe.
Utilizzando una pipetta passo-passo con punta per stub l'esca, posizionare delicatamente il volume desiderato di bleomicina o soluzione salina nella parte posteriore dell'orofaringe. Assicurarsi che una bolla di liquido visibile sia evidente. Continuare a tenere la lingua in posizione fino a quando il topo aspira la soluzione, che è visibilmente e spesso udibile.
Una volta confermata l'aspirazione, rimuovere con cura la clip nasale. Osservare il mouse in posizione sospesa per 15 secondi per assicurarsi che non vi sia reflusso della soluzione di bleomicina prima di rimetterlo nella sua gabbia. Quindi posiziona l'animale su un fianco nella sua gabbia con un termoforo sotto per mantenere la termoneutralità.
Pizzicare delicatamente le dita dei piedi e assicurarsi che gli animali rimangano eutermici per facilitare il risveglio. Monitorare i topi fino a quando non riacquistano la piena coscienza, che in genere richiede da una a due ore a seconda della dose di ketamina e delle dimensioni e del metabolismo dell'animale. Monitorare clinicamente i topi ogni giorno per verificare la presenza di variazioni del peso corporeo, della toelettatura, del livello di attività e dello stato respiratorio.
Tieni traccia del peso come indicatore chiave dell'efficacia del modello. Al momento opportuno, prelevare i polmoni dai topi correttamente soppressi. Per l'istologia, sezionare i polmoni su un blocco e fissarli in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
Procedere con l'inclusione, il sezionamento e la colorazione con ematossilina ed eosina o tricromia di Masson. Per la misurazione del collagene solubile, omogeneizzare il polmone destro. Per la citometria a flusso, digerire il polmone destro utilizzando un dissociatore tissutale e una soluzione enzimatica per ottenere una sospensione di una singola cellula.
Eseguire la colorazione e l'analisi citofluorimetrica seguendo i protocolli standard. Rispetto al controllo PBS, al settimo giorno sono stati osservati cambiamenti fibrotici nei setti alveolari e piccole aree infiammatorie o fibrotiche nei campioni polmonari trattati con bleomicina. Entro il giorno 14, sono comparse regioni fibrotiche più grandi e più confluenti con una significativa distruzione della normale architettura alveolare.
Entro il giorno 21, le alterazioni fibrotiche persistevano senza un aumento più significativo. Il sistema di punteggio di Ashcroft modificato ha confermato che i livelli di fibrosi erano simili tra i giorni 14 e 21. I dosaggi di idrossiprolina eseguiti il giorno 14 hanno dimostrato un aumento del contenuto totale di collagene solubile nei polmoni trattati con bleomicina rispetto al controllo.
L'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi ha mostrato una sovraregolazione dei geni profibrotici Col1A1 e TGFB in risposta alla bleomicina. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato una robusta infiltrazione di cellule mieloidi, inclusi macrofagi interstiziali, macrofagi alveolari derivati da monociti e neutrofili nei polmoni.
