Quindi la nostra ricerca riguarda gli adattamenti batterici alla limitazione dello zinco che vanno oltre la semplice conservazione dello zinco. Quindi usiamo i batteri patogeni, Mycobacterium tuberculosis, e non patogeni, Mycobacterium smegmatis, per vedere come la limitazione dello zinco influisce su cose come la fisiologia e la patogenesi batterica. Un'altra cosa che ci interessa sono le proteine ribosomiali alternative, che sono espresse da molti batteri durante la limitazione dello zinco, ma non sappiamo ancora molto su di esse.
Sia i micobatteri patogeni che quelli non patogeni hanno mostrato risposte drammatiche alla limitazione dello zinco, con livelli di espressione in centinaia di geni e proteine influenzati dalla disponibilità del micronutriente zinco. Fisiologicamente, ciò si traduce in una profonda morfogenesi per Mycobacterium smegmatis e in una risposta allo stress ossidativo significativamente sovraregolata sia in Mycobacterium smegmatis che in Mycobacterium tuberculosis patogeno. Questo protocollo affronta la difficoltà di riprodurre e standardizzare le condizioni per la crescita limitante dello zinco nella produzione di ribosomi alternativi traduzionalmente attivi nei micobatteri.
Abbiamo osservato fattori al di fuori del nostro controllo, come un evento di forti piogge, correlati alla contaminazione da zinco e alla preparazione limitata dei terreni di zinco. Il fenotipo del bioindicatore qui presentato garantisce la riproducibilità dei risultati di crescita che limitano lo zinco. Il fenotipo quantificabile del bioindicatore qui descritto consente di raggiungere condizioni limitanti lo zinco senza l'uso di agenti chelanti.
Pertanto, consente la produzione standardizzata di ribosomi alternativi traduzionalmente attivi e applicazioni a valle come macrofagi o infezioni animali per studiare le interazioni ospite-patogeno. Quindi il nostro laboratorio sta lavorando per comprendere le funzioni specifiche di ciascuna proteina ribosomiale alternativa e come l'incorporazione di tali proteine nei ribosomi potrebbe influenzare la traduzione. E stiamo anche cercando di vedere se i risultati che vediamo in M.smegmatis possono essere applicati anche alla MTB, e se questi possono essere utilizzati per sviluppare migliori trattamenti per la tubercolosi.
Per iniziare, aggiungere cinque millilitri di terreno 7H9-ADC a una provetta del bioreattore da 50 millilitri. Quindi aggiungere 10 microlitri di cellule madre di glicerolo scongelate di Mycobacterium smegmatis e avvitare il coperchio sul tubo. Posizionare saldamente la provetta a un angolo di circa 45 gradi e incubare a 37 gradi Celsius con 120 giri/min per 18 ore.
Dopo l'incubazione, misurare la densità ottica a 600 nanometri e confermare che è compresa tra 0,5 e 0,8. Centrifugare la coltura a 3000 x g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno a contenuto di zinco, o ZLM.
Durante la centrifugazione, sterilizzare una cuvetta riempiendola con etanolo al 70% fino a traboccare e lasciarla riposare per 10 minuti. Quindi sciacquare la cuvetta tre volte con ZLM. Dopo la centrifugazione finale, risospendere il pellet di cella in due millilitri di ZLM.
Cancellare lo spettrofotometro utilizzando 600 microlitri di ZLM in una cuvetta. Trasferire 600 microlitri di cellule lavate nella cuvetta sterilizzata e misurare l'assorbanza a 600 nanometri. Se la densità ottica è superiore a uno, utilizzare la formula data.
Per calcolare il volume di ZLM da aggiungere ai 600 microlitri di celle lavate nella cuvetta per ottenere una densità ottica di uno, aggiungere il volume calcolato di ZLM alla cuvetta. Mescolare bene pipettando da cinque a 10 volte e rimisurare l'assorbanza. Quindi, aggiungere 50 millilitri di ZLM nel pallone di plastica sterile da 250 millilitri in autoclave.
Inoculare i palloni aggiungendo 50 microlitri di coltura regolata a una densità ottica di uno dalla cuvetta. Per i terreni pieni di zinco, aggiungere 30 microlitri di solfato di zinco da 10 millimolari per ottenere una concentrazione finale di sei micromolari. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con 100 giri/min agitando per tre giorni per raggiungere la fase stazionaria.
Ogni giorno di crescita, aggiungere 200 microlitri di coltura in una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti e misurare le metriche di crescita su un lettore di micropiastre monocromatore. Per riportare la densità cellulare ottenuta da un lettore di micropiastre, generare una curva standard per convertire la lettura dalla lunghezza del percorso utilizzando un volume impostato alla lunghezza del percorso standard di un centimetro. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 420 nanometri e l'emissione a 475 nanometri per misurare la fluorescenza del cofattore F420.
Quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 375 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 475 nanometri per misurare la fluorescenza di fondo. Genera una scansione dell'intensità della fluorescenza dall'eccitazione a 230 nanometri a 440 nanometri in incrementi di cinque nanometri, con emissione fissa a 475 nanometri. Utilizzando la seguente equazione, calcolare la percentuale di intensità della fluorescenza da 375 nanometri a 420 nanometri.
Dopo tre giorni, per registrare la lunghezza delle celle, pulire un vetrino e un vetrino coprioggetti con un panno privo di lanugine. Pipettare una goccia da 10 microlitri di coltura sul vetrino e posizionare il vetrino coprioggetti. Premi delicatamente il vetrino coprioggetti in modo che la coltura si diffonda fino a riempire quasi l'intera area sottostante.
Utilizzando un microscopio composto con immersione in olio 100X e obiettivi oculari 10X Con attacco per fotocamera, visualizzare il vetrino preparato. Scattare foto di aree con più celle che sono a fuoco sul piano e non in movimento. Utilizzando lo stesso microscopio e obiettivo, creare un'immagine di un vetrino di calibrazione.
Nel software Fiji, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea lungo la lunghezza della diapositiva di calibrazione. Selezionare Analizza, quindi Imposta scala e immettere la distanza nota in unità per la barra della scala. Quindi selezionare globale per applicare la scala a tutte le immagini e le misurazioni.
Ora apri l'immagine e usa lo strumento linea retta per disegnare una linea lungo la lunghezza della cella per misurarla. Copia i dati sulla lunghezza delle celle dalla finestra pop-up in un foglio di calcolo o salvali come file con valori separati da virgole per l'analisi statistica. Le colture wild-type coltivate in ZLM hanno mostrato valori di densità ottica inferiori rispetto ai terreni pieni di zinco, con ceppi delta altRP con valori ancora più bassi.
L'allungamento cellulare è stato osservato in colture ZLM wild-type con una lunghezza media delle cellule di nove micrometri, mentre le cellule piene di zinco erano più corte a circa tre micrometri. Le celle delta altRP non hanno mostrato un allungamento significativo in condizioni limitate allo zinco. Le scansioni a fluorescenza hanno mostrato una diminuzione della fluorescenza del cofattore F420 nelle colture ZLM wild-type, con ceppi delta altRP che mostrano una variabilità della fluorescenza molto più elevata.
