La nostra ricerca si è concentrata sull'utilizzo di modelli polimicrobici complessi per comprendere le complesse interazioni tra i microbi nell'ambiente della fibrosi cistica e come ciò si traduca in un aumento della tolleranza antimicrobica. Speriamo di utilizzare queste conoscenze per sviluppare nuovi interventi terapeutici. I progressi nel campo dei biofilm sono guidati dalla visualizzazione, insieme a metodologie di quantificazione insieme ad approcci biofisici.
Ciò include tecniche come 3D OrbiSIMS che forniscono una risoluzione spaziale fino alla micro e nanoscala. Questa ricerca mira a creare un modello polimicrobico che mantenga un livello di complessità, rappresentativo di ciò che si osserva nei trattamenti antibiotici nei pazienti con FC. Consentirà inoltre una maggiore produttività, uscite più pertinenti e adattabilità ad altre varietà e condizioni.
Questo protocollo offre un ambiente di test rilevante per i patogeni FC. È robusto e ha una produttività relativamente elevata. È inoltre suscettibile di più endpoint, consentendo di intraprendere studi più complessi.
Questa ricerca ha dimostrato che un ambiente rilevante per la FC altera la suscettibilità microbica. Inoltre, il tipo di funghi presenti può anche alterare la suscettibilità di Pseudomonas aeruginosa, e questo può avere una significativa rilevanza clinica. Per iniziare, prendiamo le colture di Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans cresciute fino alla fase esponenziale.
Utilizzando una micropipetta, trasferire un millilitro di ciascuna coltura liquida in una provetta sterile separata da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette per due minuti a 8.000 x g per pellettare i batteri o i funghi. Successivamente, utilizzando una pipetta, aspirare il surnatante da ciascuna provetta e risospendere i pellet in un millilitro di PBS.
Diluire le cellule risospese di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus da uno a 10 in PBS. Quindi, utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Dopo aver diluito i campioni lavati di Candida albicans da uno a 100 in PBS, pipettare 10 microlitri di ciascun campione in due camere individuali di un emocitometro.
Quindi regolare il campione di Candida albicans a 1 x 10 alla potenza di otto CFU per millilitro in PBS. Per preparare l'inoculo per l'aggiunta al biofilm, regolare l'inoculo di Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Staphylococcus aureus utilizzando PBS. Per i biofilm monospecie, pipettare 10 microlitri del microbo diluito al centro di un disco in policarbonato posto sull'agar tecnico SCFM2 all'1,5% in piastre a 6 pozzetti.
Incubare la piastra staticamente a 37 gradi Celsius per 24 ore prima del trattamento o dell'interruzione. Per i biofilm polimicrobici, aggiungere 10 microlitri di Staphylococcus aureus e Candida albicans uno sopra l'altro sullo stesso disco di policarbonato. Incubare il disco inoculato staticamente per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione con una pinza sterile, trasferire i dischi in policarbonato su piastre di agar tecniche SCFM2 fresche all'1,5%. Aggiungere 10 microlitri di 1 x 10 alla potenza di quattro CFU per millilitro di diluizione di Pseudomonas aeruginosa sopra il biofilm prestabilito di Staphylococcus aureus, Candida albicans. Incubare per altre 24 ore a 37 gradi Celsius.
Per iniziare, prendi il biofilm della colonia di interfaccia aerea solida di Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans. Aggiungere perline di ceramica con un diametro di 2,8 millimetri alla piastra e reticolare UV la piastra. Utilizzando una pinza sterilizzata a fiamma, trasferire cinque perle di ceramica in una provetta sterile da due millilitri.
Pipettare un millilitro di PBS nella provetta di omogeneizzazione da due millilitri. Agitare i tubi per almeno 10 secondi o fino a quando il biofilm non è stato rimosso dal disco in policarbonato come determinato dall'ispezione visiva. Una volta rimosso, estrarre il disco in policarbonato, quindi posizionare i tubi con le perline nell'omogeneizzatore e batterli due volte per 10 secondi a sei metri al secondo con un intervallo di dieci secondi tra i battiti.
Ora versate il biofilm distrutto dal tubo dell'omogeneizzatore in un bijou da sette millilitri contenente quattro millilitri di PBS, ottenendo un volume finale di cinque millilitri. Centrifugare le provette dell'omogeneizzatore a 8.000 x g per due minuti. Quindi trasferisci il liquido rimanente nel bijou da sette millilitri per assicurarti che tutto il liquido venga trasferito.
Aggiungere 200 microlitri del biofilm disgregato in una piastra nera a 96 pozzetti a fondo chiaro, quindi pipettare 10 microlitri di soluzione di resazurina allo 0,02% in ciascun pozzetto. Incubare il biofilm trattato con resazurina in un lettore di piastre a 37 gradi Celsius. Applicare l'agitazione orbitale ogni 30 minuti per 10 secondi a 200 giri/min prima di effettuare qualsiasi lettura fluorescente.
Misurare la fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nanometri. I biofilm monospecie richiedevano concentrazioni significativamente più basse di meropenem e tobramicina per raggiungere un'uccisione del 50% rispetto ai biofilm polimicrobici con un aumento di due log della concentrazione di antibiotici necessaria per quest'ultimo. La sopravvivenza di Pseudomonas aeruginosa è aumentata nei biofilm polimicrobici con 64 microgrammi per millilitro di tobramicina, mentre il meropenem ha mostrato una diminuzione della sopravvivenza in condizioni simili.
Nei biofilm monospecie, è stata osservata una forte correlazione tra la sopravvivenza di Pseudomonas aeruginosa e la sua attività metabolica quando trattato sia con meropenam che con tobramicina.
