Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

La risposta al danno al DNA è un sistema cellulare che mantiene la stabilità e l'integrità del genoma. Le disfunzioni in questo processo causano diverse malattie come il cancro, le malattie legate all'età e l'infiammazione cronica. Il nostro obiettivo è identificare le proteine che cooperano in questo processo, il che consente l'identificazione di bersagli alternativi per l'integrazione terapeutica.

Per caratterizzare la partecipazione di una proteina alla risposta al danno al DNA, vengono solitamente applicati studi di immunofluorescenza con la forma fosforilata dell'istone H2AX, un marcatore di danno al DNA. Inoltre, i saggi di raccolta delle proteine, come la co-immunoprecipitazione, possono essere eseguiti dopo un danno al DNA per identificare il ruolo della proteina nella segnalazione. Gli studi di interazione si basano solitamente su saggi di immunoprecipitazione, ma questi sono in vitro e non forniscono informazioni sulla posizione dell'interazione.

L'immunofluorescenza può fornire informazioni sulla localizzazione cellulare delle proteine, ma dimostrare l'interazione può essere difficile e dipende dalla risoluzione del microscopio. Mostriamo qui che un semplice protocollo che combina il saggio del ligando di prossimità con la colorazione Gamma-H2AX consente la caratterizzazione spaziale e temporale dell'interazione delle proteine in un contesto di danno al DNA. Inoltre, abbiamo fornito una macro di facile utilizzo per l'analisi dei dati.