La formazione di procoagulanti piastrinici è fondamentale per mantenere l'emostasi. Questo processo comporta l'espressione di fosfolipidi e il rilascio di microvescicole sulla superficie piastrinica, che è essenziale per le fasi di coagulazione. Le valutazioni di questo processo hanno fornito nuovi dati su come le risposte procoagulanti piastriniche sono in diverse malattie umane.
La citometria a flusso è stata una pietra miliare e ha guadagnato un'ampia accettazione nella valutazione dell'espressione della fosfatidilserina sul rilascio di piastrine e microvescicole. L'isolamento e l'analisi delle piastrine purificate dal sangue richiedono molto tempo e attrezzature di laboratorio specializzate, e quindi non sono attualmente disponibili per la diagnosi clinica di routine. Anche l'analisi dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole è impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni e del basso numero di eventi positivi per i marcatori di interesse.
Per iniziare, raccogliere il sangue venoso periferico in provette di raccolta contenenti l'anticoagulante attivo citrato trisodico con acido citrico e destrosio. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare il sangue con l'anticoagulante e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Contare le piastrine utilizzando un contatore di cellule automatizzato per determinare la velocità corretta per la centrifugazione.
Per preparare il plasma ricco di piastrine, centrifugare il sangue a 250 g per 10 minuti a temperatura ambiente senza applicare la pausa. Quindi aggiungere 1 millilitro di ACDA e 6,25 microlitri di apirasi a 9 millilitri di plasma ricco di piastrine. Centrifugare il composto a 1,100 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando una pipetta da pascolo, rimuovere il surnatante contenente plasma povero di piastrine e risospendere delicatamente il pellet piastrinico in 1 millilitro di tampone di lavaggio. Quindi aggiungere da 3 a 4 millilitri di tampone di lavaggio alla provetta e centrifugarla nuovamente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di lavaggio.
Trasferire 150 microlitri di sospensione piastrinica in una provetta da 1,5 millilitri per contare le cellule in un contatore di cellule automatizzato. Aggiungere da 3 a 4 millilitri di tampone di lavaggio alla sospensione rimanente per eseguire un ulteriore lavaggio come dimostrato in precedenza. Quindi, risospendere il pellet piastrinico nel tampone di reazione per ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 alla potenza di 11 piastrine per litro.
Per iniziare, ottenere le piastrine lavate nel tampone desiderato per la citometria a flusso. Preparare tutti gli agonisti e i fluorocromi nel tampone di reazione. Per i test interni, aggiungere 100 microlitri di piastrine lavate a una concentrazione di 50 x 10 alla potenza di 9 piastrine per litro in diversi tubi di trattamento.
Agitare delicatamente ogni aliquota e incubare a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi aggiungere 5 microlitri di annessina V-FITC non diluita a ciascuna microprovetta e incubare. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di reazione a ciascuna provetta per arrestare il processo.
Gate la popolazione piastrinica utilizzando la diffusione diretta o FSC e utilizzare i grafici di densità per identificare ogni popolazione in modo indipendente. Impostare il cutoff negativo all'estrema destra della popolazione piastrinica dello stato a riposo. Dopo l'attivazione, classificare gli eventi a destra di questo cutoff come piastrine che espongono la fosfatidilserina.
Per differenziare le microvescicole, impostare il cutoff al valore FSC più basso osservato nella popolazione piastrinica a riposo. Dopo l'attivazione, classificare gli eventi positivi alla fosfatidilserina al di sotto di questa soglia come microvescicole. Le misurazioni di base hanno indicato che meno del 2,9% delle piastrine non attivate mostrava esposizione alla fosfatidilserina.
Dopo l'attivazione, il 26,7% delle piastrine è diventato positivo alla fosfatidilserina con il collagene, il 9,1% con la trombina e il 36,2% con collagene e trombina. Il trattamento con ionofori ha portato al 49,6% di piastrine positive alla fosfatidilserina. La proporzione basale di microvescicole era dello 0,3%Aumenti significativi sono stati osservati solo con collagene e trombina insieme a circa l'11,4% e ancora di più con gli ionofori al 44%
