L'ambito della nostra ricerca è in quest'area dell'organogenesi epatica. La domanda a cui stiamo cercando di rispondere è come fa il fegato a diventare così grande e usarlo in un approccio di ingegneria inversa per costruire tessuto epatico dalle cellule staminali. Gli sviluppi più recenti nel nostro campo della medicina rigenerativa del fegato riguardano la miniaturizzazione.
Stiamo usando le cellule staminali per creare tessuti in miniatura che replicano l'organo reale e, in questo modo, possiamo studiare la formazione degli organi e la biologia degli organi. Il nostro laboratorio ha ottenuto diversi risultati significativi nel campo della medicina rigenerativa del fegato. Utilizzando alcune di queste tecniche di miniaturizzazione, abbiamo identificato passaggi chiave durante l'organogenesi del fegato, tra cui la morfogenesi e la migrazione cellulare.
E quindi questa è una delle nostre scoperte chiave sul campo. I vantaggi del nostro protocollo all'interno di questa pubblicazione consentono diverse tecniche di organoidi durante la miniaturizzazione. Quindi, in sostanza, ora possiamo studiare processi come la ramificazione, la morfogenesi e altri aspetti della migrazione in un tessuto epatico in miniatura che nessun'altra tecnica può fornire.
Le domande di ricerca che porremo in futuro, a causa del lavoro che abbiamo fatto finora, riguardano il modo in cui la crescita e la migrazione delle cellule, come sono coordinate? E chiederemo anche dei meccanismi con cui possiamo assemblare i tessuti in tessuti più grandi che assomigliano al fegato. Per iniziare, coltiva cellule di epatoblastoma umano HepG2 wild-type in un pallone T75 a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno ogni giorno.
Al raggiungimento dell'80% di confluenza, sciacquare le celle con PBS. Dopo aver scartato il PBS, incubare le cellule con cinque millilitri di tripsina EDTA allo 0,05%. Quindi aggiungere quantità uguali di cDMEM per lavare le celle dal pallone.
Una volta che le cellule si sono staccate, trasferire la miscela in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri e centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver risospeso le cellule in cDMEM, contare le cellule per determinare la concentrazione finale in cellule per millilitro. Per etichettare le cellule, centrifugarle a 300 G per cinque minuti in un tubo conico da 15 millilitri.
Risospendere il pellet in un terreno di crescita privo di siero per ottenere una concentrazione finale di una volta 10 alla potenza di sei cellule per millilitro e incubarle con cinque microlitri di soluzione fluorescente per la marcatura cellulare per millilitro di sospensione cellulare in rotazione. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 450 G per cinque minuti e risospendere il pellet di cella in cDMEM fresco. Per la formazione di sferoidi, mescolare il pozzetto di sospensione cellulare ed erogare 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti rivestita di agarosio.
Centrifugare la piastra a 340 G per 10 minuti e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per cinque-nove giorni. Gli sferoidi epatici, indipendentemente dalle dimensioni, si compattavano completamente entro il quinto giorno, passando da traslucidi a opachi man mano che si addensavano. Per iniziare, ottenere sferoidi epatici e mesenchimali in piastre a 96 pozzetti.
Utilizzando una pipetta, raccogliere singolarmente i fibroblasti del prepuzio umano o gli sferoidi HFF MRC-5 in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri contenente cDMEM fresco. Incubare gli sferoidi per cinque minuti sul ghiaccio per farli depositare, quindi sciacquarli delicatamente con cDMEM caldo. Utilizzando una pipetta, trasferire delicatamente un singolo sferoide HFF MRC-5 in un pozzetto contenente uno sferoide wild-type G2 per epatoblastoma umano.
Incubare gli sferoidi con il fattore di crescita ridotto a freddo come ghiaccio Matrigel in una diluizione 1:1. Quindi, aggiungere 75 microlitri di cDMEM fresco a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o tre giorni. La microscopia a fluorescenza e l'analisi delle immagini hanno confermato che la formazione assembloide ha avuto successo in diverse matrici e mezzi, anche se sono state notate lievi variazioni morfologiche.
Ulteriori analisi hanno rivelato che una maggiore vicinanza degli sferoidi ha portato a tempi di compattazione più rapidi. Per iniziare, ottieni sferoidi epatici da cellule di tipo selvatico G2 dell'epatoblastoma umano. Raccogli gli sferoidi singolarmente in una centrifuga conica sterile da 15 millilitri e posiziona la provetta sul ghiaccio per far depositare gli sferoidi.
Quindi, aspirare con cura il fluido dal tubo. In una provetta sterile separata da 15 millilitri, miscelare un millilitro di Matrigel o GFR MG a ridotto fattore di crescita ghiacciato e terreno di crescita di controllo ghiacciato con una diluizione 1:1. Aggiungere la miscela nella provetta contenente gli sferoidi, garantendo una distribuzione uniforme degli sferoidi.
Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, raccogliere 15 microlitri di un singolo sferoide nella soluzione MG e seminarlo lentamente su una piastra di Petri da 60 millimetri. Quindi, incubare le goccioline a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 60 minuti e aggiungere lentamente cinque millilitri del terreno di coltura desiderato alla capsula di Petri. Gli sferoidi di Hep hanno sviluppato spessi filamenti migratori che sporgono verso i cluster di fibroblasti entro il nono giorno.
Per iniziare, raccogliere i fibroblasti del prepuzio umano, o cellule HFF MRC-5, e seminarli in un pallone trattato con coltura tissutale T75 a una densità di 5.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 72 ore in 15 millilitri di cDMEM. Successivamente, raccogliere il terreno condizionato mesenchimale, o M-CM, in una provetta conica sterile da 15 millilitri e centrifugarlo a 290 G per cinque minuti per rimuovere i detriti.
Filtrare il surnatante con un filtro da 0,2 micrometri per la sterilizzazione e trattenere il filtrato. Quindi, diluire l'M-CM con un terreno di coltura completo con un rapporto di diluizione fino a 1:7 per l'esperimento desiderato. Sospendi le cellule HFF MRC-5 in cDMEM fresco per ottenere una concentrazione finale di sei volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro e posiziona la provetta sul ghiaccio.
Mescolare la sospensione cellulare e il fattore di crescita ghiacciato ha ridotto il collagene Matrigel o coda di ratto in diluizione 1:1. Trasferire 100 microlitri di HFF MRC-5 e la soluzione di Matrigel in un pozzetto contenente uno sferoide epatico e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Infine, aggiungere 75 microlitri di cDMEM fresco a ciascun pozzetto e incubare per un massimo di 12 giorni.
La migrazione collettiva è stata efficacemente indotta in vitro utilizzando la formazione di goccioline di sferoidi epatici con M-CM. Gli effetti concentrazione-dipendenti di M-CM hanno favorito l'emergere di filamenti cellulari e ramificazioni dagli sferoidi. Entro l'undicesimo giorno, le sporgenze cellulari degli sferoidi sono diventate più pronunciate, formando fogli interconnessi.
