Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV

L'obiettivo generale di questo test è quello di somministrare un approccio multiplex per la rilevazione simultanea di virus respiratori comunemente circolanti come SARS-CoV-2, MERS, influenza A e influenza B.Le tecnologie prevalenti che guidano i progressi nel nostro campo includono CRISPR, saggi amminometrici a flusso laterale, sensori biomolecolari basati su carta, test Sherlock in un vaso, aptameri del DNA e multiplex RT-qPCR integrato con amplificazione isotermica mediata da loop, LAMPADA. Tuttavia, la RT-qPCR multiplex è la più sensibile, comune ed è il gold standard per la diagnosi di vari virus. L'attuale sfida sperimentale è quella di stabilire un protocollo che possa essere utilizzato per rilevare copie di RNA a partire da 10 copie.

Per il test abbiamo utilizzato il kit RT-qPCR interno, che è efficiente in termini di tempo e costi. Per iniziare, preparare il tampone 2x per RT-qPCR in acqua priva di DNA/RNA Conservare il tampone a meno 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Quindi, mescolare i primer e le sonde in un tubo da 1,5 millilitri.

Prelevare il volume con il tampone di eluizione, quindi conservare la provetta a meno 20 gradi Celsius. Preparare una miscela enzimatica con taq polimerasi e MMLV-RT in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio. Compensare il volume con il tampone di conservazione della polimerasi taq.

Ora risospendere gli RNA sintetici virali in provette separate con 100 microlitri di tampone Tris-EDTA per ottenere scorte da 10 a un sesto di copie di RNA per microlitro. Per mescolare le scorte di virus, aggiungere cinque microlitri ciascuno di SARS-CoV-2, influenza A e B a 50 microlitri di tampone Tris-EDTA. Allo stesso modo, mescolare SARS-CoV-2 e MERS-CoV per ottenere una seconda miscela virale.

Diluire entrambe le miscele dieci volte per ottenere una diluizione finale di 10 copie di RNA per microlitro. In ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, pipettare 2 tamponi, primer, enzima, acqua priva di DNA/RNA e le corrispondenti miscele di RNA. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre.

Quindi centrifugare la piastra per un minuto per raccogliere il liquido sul fondo del pozzetto. Successivamente, programmare la macchina PCR in modo che accetti il tipo di blocco veloce a 96 pozzetti con il tipo sperimentale impostato sulla curva standard. Impostare i reagenti su Reagenti TaqMan e selezionare le proprietà di esecuzione standard.

Definire i bersagli genetici e il colorante reporter. Quindi definisci i nomi dei campioni per ogni reazione da testare e assegna target e campioni al layout della piastra. Inserire ora il programma del ciclo nello strumento.

Trasferire la piastra alla macchina QPCR in tempo reale con l'orientamento corretto e premere Esegui per avviare il ciclo. Scegli la posizione del file per salvare i dati sperimentali. Quindi esaminare i grafici di amplificazione forniti dal programma QPCR.

I due kit sviluppati sono stati in grado di amplificare con successo tutti e tre i geni bersaglio contemporaneamente, con un minimo di 10 copie di RNA per reazione. L'efficienza di amplificazione per tutte le titolazioni virali è stata superiore al 99%