פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לנהל גישה מרובה לזיהוי בו זמנית של וירוסים נשימתיים נפוצים במחזור כגון SARS-CoV-2, MERS, שפעת A ושפעת B. הטכנולוגיות הרווחות המניעות את ההתקדמות בתחומנו כוללות CRISPR, מבחני אמינו זרימה רוחבית, חיישנים ביומולקולריים מבוססי נייר, בדיקת שרלוק בסיר אחד, אפטמרים DNA ומולטיפלקס RT-qPCR משולב עם הגברה איזותרמית בתיווך לולאה, מנורה. עם זאת, מולטיפלקס RT-qPCR הוא הרגיש ביותר, הנפוץ ביותר והוא תקן הזהב לאבחון וירוסים שונים. האתגר הניסויי הנוכחי הוא להקים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לזהות עותקי RNA נמוכים עד 10 עותקים.

השתמשנו בערכת RT-qPCR פנימית לבדיקה, וזה חסכוני בזמן ובעלות. כדי להתחיל, הכן את המאגר 2x עבור RT-qPCR במים נטולי DNA/RNA אחסן את המאגר במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר מכן, מערבבים את הפריימרים והבדיקות בצינור של 1.5 מיליליטר.

הרכיבו את הנפח בעזרת מאגר פליטה, ואז אחסנו את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו תערובת אנזימים עם טאק פולימראז ו-MMLV-RT בשפופרת של 1.5 מיליליטר על קרח. הרכיב את הנפח עם מאגר אחסון taq פולימראז.

כעת השעו מחדש את ה-RNA הסינתטי הנגיפי בצינורות נפרדים עם 100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA כדי ליצור מלאי של 10 עד שישי עותקי RNA למיקרוליטר. כדי לערבב את מלאי הנגיף, הוסף חמישה מיקרוליטר כל אחד של SARS-CoV-2, שפעת A ו-B ל-50 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA. באופן דומה מערבבים SARS-CoV-2 ו-MERS-CoV לקבלת תערובת ויראלית שנייה.

מדללים את שתי התערובות פי עשרה כדי לקבל דילול סופי של 10 עותקי RNA למיקרוליטר. לכל באר של צלחת 96 בארות, פיפטה 2x מאגר, פריימר, אנזים, מים נטולי DNA/RNA ותערובות ה-RNA המתאימות. אטום את הצלחת עם חותם צלחת דבק.

ואז צנטריפוגה את הצלחת למשך דקה אחת כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הבאר. לאחר מכן תכנת את מכונת ה-PCR לקבל את סוג בלוק הבאר המהיר 96 עם סוג הניסוי המוגדר לעקומה סטנדרטית. הגדר את הריאגנטים לריאגנטים של TaqMan ובחר מאפייני הפעלה רגילים.

הגדר את מטרות הגן ואת צבע המדווח. לאחר מכן הגדר את שמות הדגימות עבור כל תגובה שתיבדק והקצה מטרות ודגימות לפריסת הצלחת. כעת הזן את תוכנית המחזור למכשיר.

העבר את הצלחת למכונת QPCR בזמן אמת בכיוון הנכון ולחץ על הפעלה כדי להתחיל את המחזור. בחר את מיקום הקובץ לשמירת נתוני הניסוי. לאחר מכן בחן את חלקות ההגברה המסופקות על ידי תוכנית QPCR.

שתי הערכות שפותחו הצליחו להגביר בהצלחה את כל שלושת גני המטרה בו זמנית, עם עד 10 עותקי RNA לכל תגובה. יעילות ההגברה עבור כל הטיטרציות הוויראליות הייתה מעל 99%