Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sui cheloidi. I fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca cheloide. Iniziare utilizzando pinzette sterili per posizionare il tessuto cheloide in un tubo da centrifuga sterile da 50 millilitri contenente da 10 a 25 millilitri di PBS integrato con 1% PSA.

Nel frattempo, aggiungere quattro millilitri di soluzione PSA PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Ora estrarre il tessuto dal tubo e lavare due volte con la soluzione PBS PSA. Utilizzando un paio di pinze sterili, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.

Quindi rimuovere gli strati adiposo ed epidermico con le forbici chirurgiche, lasciando intatto il derma. Utilizzare un paio di forbici per sezionare il derma tagliato in pezzi da tre a cinque millimetri quadrati e trasferire i pezzi al pozzetto successivo con un paio di pinze sterili. Lavare i pezzi in soluzione PBS PSA.

Utilizzando una pinza sterilizzata, posizionare da 10 a 30 pezzi di tessuto dermico distanziati di meno di cinque millimetri in piastre di Petri. Mettere i piatti capovolti in un'incubatrice fino a quando i pezzi si asciugano e si attaccano al piatto. Quindi, aggiungere sette millilitri di DMEM integrato con 10% FBS e 1% PSA e incubare i piatti come prima.

Dopo tre giorni, sostituire metà del surnatante con terreno di coltura completo. Osservare i fibroblasti ogni giorno sotto un ingrandimento microscopico 40X. Rimuovere i pezzi di tessuto nel terreno di coltura quando i fibroblasti raggiungono il 90% di confluenza.

Lavare i fibroblasti in PBS e aggiungere due millilitri di soluzione sterile di tripsina EDTA. Dopo aver incubato le cellule in un incubatore umidificato, picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Aggiungere due millilitri di mezzo completo per terminare la digestione una volta che la maggior parte delle cellule si sono staccate.

Ora trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di nove centimetri e incubare in un incubatore umidificato.

Per eseguire l'analisi immunofluorescente dopo aver coltivato i fibroblasti su vetrini rotondi e averli incubati in anticorpi primari e secondari, aggiungere 50 microlitri di soluzione DAPI al vetrino per colorare i nuclei cellulari. Posizionare le copertine lavate su vetrini con una pinza. Infine, trasferire i campioni in una scatola scura bagnata per la microscopia fluorescente.

Le escrescenze di fibroblasti del tessuto sono state osservate cinque giorni dopo l'elaborazione. I fibroblasti hanno mostrato alti tassi di proliferazione e hanno raggiunto la confluenza dopo 10 giorni. I fibroblasti avevano corpi cellulari allungati e simili a fusi, che erano allineati in fasci ad alta confluenza.

La colorazione immunofluorescente ha restituito immunofluorescenza rossa positiva dei fibroblasti e immunofluorescenza blu del nucleo cellulare. I test citometrici a flusso hanno mostrato positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti. Questo studio ha descritto un metodo ottimizzato e fornito istruzioni chiare per risolvere le sfide esistenti e aumentare le possibilità di successo per l'isolamento e la coltura dei fibroblasti cheloidi.