Durante la registrazione dell'imaging del calcio, le cellule si muovono in tutte le direzioni. Sono stati sviluppati molti strumenti per correggere il movimento X e Y, ma anche il movimento sull'asse Z deve essere esplicitamente diagnosticato e corretto. TACI è un plug-in J di immagini open source di facile utilizzo.
Controlla la deriva Z e analizza l'imaging 3D del calcio con movimento in tutte le direzioni. Dopo aver preparato le larve di mosca, sciacquarle in PBS tre volte. Pipettare 75 microlitri di PBS al centro di un vetrino.
Metti una o due larve in PBS e posiziona la termocoppia micrprobe vicino alle larve. Coprire le larve e la microsonda della termocoppia con un vetrino di copertura e sigillarlo con lo smalto. Posizionare il vetrino sul palco del microscopio.
Trova la messa a fuoco usando un obiettivo 25 volte e posiziona il dispositivo di raffreddamento termoelettrico sulla diapositiva. Nel software confocale, concentrarsi sulle cellule fluorescenti di interesse. Regolare la potenza del laser per evitare la sovrasaturazione e impostare la prima e l'ultima posizione della fetta nell'impostazione dello stack Z.
Contemporaneamente, avviare la scansione dello stack Z e la registrazione della temperatura. Controlla l'alimentatore che alimenta il Peltier per modificare la temperatura superficiale del Peltier. Successivamente, interrompere la scansione dello stack Z e la registrazione della temperatura.
Dopo aver scaricato il TACI calcium imaging dot jar installa il plugin nelle Fiji facendo clic sui plugin nella barra dei menu, quindi installa nel menu a discesa. Quindi riavviare Fiji ed eseguire il plug-in facendo clic su plug-in e scegliendo TACI calcio imaging. Scegliere la funzione di ridenominazione per convertire i nomi dei file TIFF nella struttura richiesta.
Scegliere la cartella in cui è necessario rinominare le immagini TIFF facendo clic su Sfoglia cartelle e attendere che il nome del file venga riempito automaticamente utilizzando il nome della cartella. controllare la posizione T massima e la posizione Z massima. Assicurarsi che i valori dei parametri per la posizione massima T e la posizione massima Z includano tutte le cifre.
Immettere la posizione di ciascun parametro nell'ordine indicato. Se i nomi dei file TIFF non includono la frase e il canale, lasciare vuoto il valore del parametro corrispondente e scegliere NA in ordine. Se è presente un posttext, aggiungere al parametro posttext.
Fare clic su Rinomina per creare una cartella con lo stesso nome, seguito dal carattere di sottolineatura R.Osservare che i nomi dei file TIFF sono stati ristrutturati nella cartella per essere compatibili con la funzione di organizzazione. Quindi, utilizzare la funzione di organizzazione per salvare le immagini TIFF nella stessa posizione Z in una cartella. Scegliere la cartella in cui è necessario organizzare le immagini T facendo clic su Sfoglia cartelle.
Se il file CSV dei parametri esiste, attendere che i valori dei parametri vengano compilati automaticamente. Se il file CSV dei parametri non esiste, inserire manualmente i valori dei parametri. Assicurarsi che i valori dei parametri di fase e canale includano lettere se presenti, mentre i valori dei parametri della posizione T e della posizione Z dovrebbero essere i numeri più grandi delle posizioni T e Z.
Se i nomi dei file di immagine non includono la fase o il canale, immettere NA. Quindi crea immagini TIFF in scala di grigi quando necessario assicurandoti che la casella R immagini grigie sia deselezionata. Fare clic su Organizza per creare una cartella con lo stesso nome seguita da pile di caratteri di sottolineatura grigi e per generare cartelle con lo stesso nome seguite dal carattere di sottolineatura e dal numero di posizione Z nella cartella. Quindi osservare che i file TIFF sono ordinati nelle cartelle corrispondenti in base alle posizioni Z e che viene generato un file denominato param dot CSV in cui è possibile trovare i parametri e i relativi valori.
Ora usa trackmate nelle Fiji per estrarre le intensità di fluorescenza delle cellule di interesse da ogni posizione Z. Apri le immagini TIFF in una cartella di posizione Z delle Fiji ed esegui TRACKMATE facendo clic sui plugin e selezionando il tracciamento, seguito da Trackmate. Regolare i parametri utilizzando i rilevatori DOG o LOG.
Modificare la soglia del diametro BLOB e il filtro mediano. Impostare i filtri per rimuovere i segnali irrilevanti. Impostate la distanza massima di collegamento, la distanza massima di chiusura della distanza e la distanza massima di fotogramma di chiusura della fessura.
Esportare le intensità di fluorescenza delle regioni di interesse in un file CSV. Per ogni neurone, creare una cartella e denominarla usando il numero del neurone. A partire dal neurone zero.
Salvare i file CSV contenenti le informazioni sulla fluorescenza del neurone corrispondente nella cartella. Denominare i file CSV come intensità media Z posizione numero punto CSV e includere almeno due colonne, posizione T e intensità media o intensità media canale uno. Crea il file CSV del punto dell'elenco di sottolineatura in background che contiene le informazioni di tutti i neuroni in un formato specifico, a partire dal neurone zero.
Inserisci i numeri dei neuroni come il neurone zero nella prima riga. Quindi fornire l'intensità di fondo per ogni posizione Z analizzata. Se vengono analizzate quattro posizioni Z per il neurone zero, riempire quattro valori di intensità di fondo sotto il neurone zero.
Salvare l'elenco di sfondo creato con il file CSV e le cartelle contenenti i file CSV delle informazioni di fluorescenza in una cartella. Apri TACI e scegli la funzione di estrazione. Quindi scegliere la cartella facendo clic su sfoglia file.
Il file in background viene compilato automaticamente. Compilare il maggior numero di posizioni T per il numero di posizioni T. Fare clic su Estrai per creare una cartella dei risultati che includa i file CSV e i grafici di ciascun neurone.
I file CSV includono l'intensità massima di fluorescenza e delta F su delta zero in ogni posizione T. I grafici sono grafici a linee delle posizioni delta F su F zero rispetto a T. Utilizzando la funzione di unione, calcolare la media del delta F su F zero da tutti i neuroni.
Calcola il SEM e traccia il delta medio F su F zero su posizioni T. Scegli la cartella dei risultati creata dalla funzione di estrazione facendo clic su sfoglia file. Inserisci il numero di posizioni T con il maggior numero di posizioni T.
Fare clic su Unisci per creare una cartella di dati uniti, che include un file CSV di dati sottolineati uniti e un carattere di sottolineatura medio Grafico PNG DF con carattere di sottolineatura F zero punto. Il file CSV include le informazioni sulla media e sul delta SEM F su F zero in ogni posizione T. Il grafico è un grafico a linee del delta medio F su F zero su posizioni T.
L'imaging del calcio delle cellule fredde larvali di mosca che esprimono GCaMP sei M mostra a malapena qualsiasi fluorescenza nello stato inattivo a 27 gradi Celsius. Tuttavia, i livelli di calcio intracellulare sono aumentati rapidamente a 10 gradi Celsius. I livelli di calcio sono scesi rapidamente quando la temperatura è stata aumentata.
L'imaging del calcio dei neuroni cerebrali del moscerino che esprimono GCaMP sei F al tempo 0,1 ha mostrato fluorescenza in quattro dei sette neuroni e l'intensità di questi neuroni è diminuita nel tempo. In presenza di octinal, più neuroni si sono illuminati. La fluorescenza di 10 neuroni è aumentata simultaneamente al punto temporale 92, suggerendo che questi neuroni dei funghi rispondono all'odore ottanale.
TACI può separare celle sovrapposte. In questa immagine di proiezione massimale, sono stati identificati due neuroni sovrapposti. Questi neuroni sono stati separati nella vista dell'orthro, indicando che questi neuroni apparivano in diverse posizioni Z.
La cella arancione mostrava il segnale più forte su Z sette mentre la cella blu aveva il segnale più forte su Z 10. Il cambiamento di fluorescenza di queste due cellule e ha rivelato l'attivazione ritardata ma forte della cellula arancione. Durante l'estrazione, il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni Z in cui appare un neurone viene utilizzato per rappresentare l'intensità del neurone alla deposizione corrispondente.
Se si utilizza TACI per analizzare un gran numero di neuroni, alcune registrazioni tra le posizioni Z devono essere incluse in una nuova funzione da sviluppare organizzata con informazioni di fluorescenza. TACI fornisce un approccio computazionale open source di facile utilizzo per l'analisi dell'imaging di capsule 3D per controllare il movimento delle cellule sull'asse Z quando le singole celle appaiono in più posizioni Z.
