Questo protocollo di dielettroforesi indotta dalla luce o LiDEP fornisce un metodo passo-passo per la caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali umane. Questo metodo può aiutare a fornire risposte sull'eterogeneità dei campioni di cellule staminali. Il vantaggio di LiDEP è la capacità di apportare modifiche in tempo reale alla configurazione dell'elettrodo virtuale in risposta all'eterogeneità delle cellule staminali che non è possibile per i metodi DEP tradizionali.
Un nuovo utente di questa tecnica potrebbe avere difficoltà a condensare la luce del proiettore abbastanza sul dispositivo micro fluidico per creare l'elettrodo virtuale. Consigliamo di riconfigurare l'installazione fino a quando non funziona. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Zuri Rashad, uno studente laureato del mio laboratorio.
Per iniziare preparare il microcanale perforando fori di quattro millimetri di diametro su un nastro biadesivo a circa cinque-sei millimetri dal bordo della dimensione più corta e centrato tra i lati più lunghi del nastro. Utilizzando un bisturi, tagliare due linee rette a tre millimetri di distanza attraverso i fori assicurandosi che i fogli protettivi su entrambe le facce del nastro siano accesi durante l'intero taglio a microcanali. Contrassegnare l'intera posizione con un pennarello lavabile assicurandosi che i fori praticati si allineino con i fori perforati nel nastro biadesivo.
Questi due fori saranno utilizzati come fori di ingresso e uscita del dispositivo microfluidico. Praticare due fori di tre millimetri di diametro nella vetrata ITO superiore. Successivamente, sulla parte superiore del vetro rivestito ITO forato, posizionare il bordo lungo del nastro allineandolo con il bordo lungo del vetro.
Rimuovere un lato della pellicola protettiva sul nastro biadesivo. Allineare i fori del nastro nella vetrata ITO superiore e premerli delicatamente insieme rimuovendo le sacche d'aria, specialmente vicino al microcanale. Rimuovere l'altra pellicola protettiva dal nastro biadesivo.
Premere sul vetrino ITO rivestito di molibdeno e silicone amorfo corrispondente al bordo del vetrino fotoconduttivo opposto al lato di gioco di due millimetri con il bordo del nastro biadesivo verso il centro del vetrino ITO superiore. In questo modo, esiste una sbornia tra l'ITO e la diapositiva ITO fotoconduttiva. Premere su una superficie piana per garantire una buona adesione e tagliare il nastro in eccesso sui lati.
Per collegare il generatore di funzioni, applicare del nastro di rame ai bordi dello strato di vetro ITO e dello strato di vetro ITO rivestito fotoconduttivo. Avvolgere il nastro sul lato del materiale ITO o fotoconduttivo dal bordo del nastro biadesivo a circa tre centimetri sul lato non rivestito del substrato di vetro. Per garantire la corretta fabbricazione del dispositivo, utilizzare un altimetro per testare la lettura della resistenza tra le guide rivestite di entrambi i substrati di vetro e il nastro di rame collegato al vetro.
Aggiungere 25 millilitri di acqua ultrapura in un tubo conico da 50 millilitri contenente 4,25 grammi di saccarosio e 0,15 grammi di glucosio. Mescolare bene fino a quando metà del saccarosio e del glucosio si scioglie e portare a termine con acqua ultrapura fino al segno di 50 millilitri. Quindi mescolare vigorosamente questo buffer DEP fino a completa dissoluzione.
Mettere 20 millilitri della soluzione di saccarosio e glucosio preparata in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 0,1 grammi di albumina sierica bovina, BSA, nel tubo. Vortice bene fino a quando tutto il BSA si dissolve per ottenere una concentrazione finale dello 0,5% BSA nel tampone DEP.
Posizionare una volta 10 alle sei cellule staminali mesenchimali umane o HMSC o rene embrionale umano, HEK293 sospeso in un millilitro di terreno di crescita in una provetta da centrifuga da 10 millilitri. Centrifugare, le celle HEK293 a 201 G per cinque minuti e le HMSC a 290 G per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante.
01 E risospendere delicatamente le celle in una soluzione tampone DEP da un millilitro con 0,5% BSA. Ripetere la centrifugazione altre due volte e risospendere le celle nel tampone DEP con 0,5% BSA. Preparare gli elementi di configurazione sperimentale come un laptop, un proiettore, un obiettivo, un microscopio digitale e un generatore di funzioni per quantificare le risposte cellulari a LiDEP.
Posizionare l'obiettivo 10x, il chip LiDEP e il supporto sulla parte superiore dell'obiettivo del proiettore. Utilizzare il laptop per progettare proiezioni luminose come stella, diamante, tre linee e ovale e collegare il laptop al proiettore. Collegare il chip LiDEP al generatore di funzioni per applicare il campo elettrico CA.
Per osservare le cellule che subiscono la forza LiDEP, utilizzare un microscopio digitale per la registrazione NVIDIA di imaging. Dopo aver completato la configurazione, lavare il microcanale con etanolo al 70%, quindi lavare la soluzione BSA allo 0,5% per rimuovere l'etanolo nelle celle precedenti. Ripetere il lavaggio tre volte per garantire il lavaggio completo poiché le celle precedentemente esposte al campo DEP risponderanno in modo diverso rispetto alle celle fresche e potrebbero interrompere la raccolta dei dati.
Rimuovere la soluzione allo 0,5% BSA con una pipetta. Quindi, impostare il generatore di funzioni sulla tensione e la frequenza desiderate. Aggiungere con cautela 70 microlitri della sospensione cellulare preparata nel microcanale del dispositivo utilizzando una punta della pipetta più piccola, inclinandola leggermente nel foro verso il microcanale per evitare fuoriuscite dovute alla sottigliezza del microcanale.
Pulisci la soluzione di accesso con salviette di carta monouso e gettale nei rifiuti a rischio biologico. Quindi, proiettare i cerchi di elettrogeometria virtuale desiderati, diamanti, stelle o linee parallele sul chip LiDEP. Nel software del microscopio digitale, impostare la durata del video su tre minuti.
Impostare un timer di laboratorio su due minuti e 30 secondi. Una volta che le cellule sono ferme nel microcanale del chip LiDEP, premere start nel software del microscopio digitale per iniziare il processo di registrazione video. Dopo 10 secondi, premere il pulsante On dell'uscita del canale del generatore di funzioni per applicare il campo elettrico CA e premere start per il timer.
Monitorare il comportamento DEP della cella attraverso il microscopio digitale e prevenire scuotimenti o movimenti intorno alla configurazione. Una volta spento il timer, premere il pulsante On dell'uscita del canale del generatore di funzioni che disattiva l'uscita del canale e il campo elettrico CA non viene più alimentato attraverso gli elettrodi. Interrompere la registrazione video dopo tre minuti e salvarla per analisi future.
Pipettare le celle fuori dall'estremità di uscita del chip LiDEP spingendo lentamente 60 microlitri di tampone DEP con 0,5% BSA nel microcanale e contemporaneamente raccogliendo l'uscita. Continuare fino a quando non ci sono poche o nessuna cella nel microcanale e ripetere il DEP con tutte le frequenze come dimostrato. Sono state determinate le risposte del DEP in termini di velocità per gli HMSC e la loro percentuale di vitalità.
Le misurazioni delle risposte DEP positive a cinque, 10, e 20 picco di tensione al picco o VPP hanno mostrato che le celle si muovevano su una velocità media di 0,025, 0,036 e 0,051 micrometri al secondo rispettivamente. I risultati di vitalità degli HMSC dopo aver sperimentato la forza DEP hanno mostrato che le tensioni più elevate hanno generalmente comportato una minore vitalità delle celle con il 57% delle celle vitali a 20 VPP. Per questo studio sono stati scelti elettrodi di colore bianco, giallo, rosso e blu, ma l'illuminazione attraverso il chip di profondità LiDEP è stata influenzata dallo strato fotoconduttivo, che aveva un colore rosso arancio.
Quindi, l'elettrodo bianco proiettato appariva giallo con un interno bianco, l'elettrodo rosso appariva arancione con un contorno rosso e l'elettrodo blu appariva verde chiaro. Questo fenomeno suggerisce che il giallo e il bianco avevano il campo DEP più forte mentre il blu e il rosso erano più deboli. Le risposte DEP degli HMC sono state misurate con LiDEP in tre analizzatori di profondità a 10 VPP.
Con LiDEP, c'è stato un decadimento della risposta DEP positiva da 30 kilohertz a 20 megahertz. Dai tre analizzatori, le celle sono aumentate nel DEP positivo da 37 a 255 kilohertz e diminuite nel DEP positivo da 1.772 kilohertz a 20 megahertz. Due componenti importanti in questo metodo sono una forte fonte di luce e una solida connessione elettrica per garantire la produzione del campo elettrico e la manipolazione delle celle.
Abbiamo osservato la rotazione delle cellule in risposta agli elettrodi virtuali. Pertanto, l'elettrorotazione è un altro metodo di analisi cellulare che può essere eseguito. L'elettrorotazione fornirebbe informazioni sull'eterogeneità delle HMSC e sulle rare sottopopolazioni.
