Con il crescente interesse per le terapie cellulari, sono necessari nuovi metodi per valutare la funzionalità di queste cellule. Questo protocollo consente la valutazione in vitro a lungo termine di questi attecchimenti cellulari in un contesto neurale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che tutti i componenti provengono da un'origine umana.
Inoltre, l'attecchimento può essere facilmente tracciato e l'ambiente dell'organoide può essere facilmente modificato, il che consente di testare diversi farmaci o tipi di trattamenti. A dimostrare questa tecnica sarà Iliana Ibanez, una talentuosa dottoranda nel mio laboratorio. Iniziare rimuovendo la sospensione unicellulare di cellule staminali pluripotenti indotte o cellule progenitrici neurali derivate da iPSC, o NPC, dal ghiaccio e centrifugandole a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 milligrammi per millilitro di matrice di membrana basale solubilizzata per ottenere un volume finale di due microlitri per iniezione. Riposizionare immediatamente la sospensione sul ghiaccio fino all'uso. Trasferire la siringa pre-raffreddata dal congelatore a 20 gradi Celsius in un secchiello per il ghiaccio per un ulteriore utilizzo.
Quindi, rimuovere la piastra dell'organoide cerebrale dall'incubatrice e trasferire l'organoide in una piastra da 35 millimetri utilizzando una punta a foro largo. Per stabilizzare gli organoidi e facilitare l'iniezione, rimuovere il terreno il più possibile senza danneggiare l'organoide. Posizionare la capsula da 35 millimetri contenente l'organoide sotto un microscopio da dissezione per facilitare l'iniezione.
Una volta che gli organoidi sono pronti per l'iniezione, risospendere delicatamente le cellule NPC marcate con EGFP utilizzando un puntale per pipette P20 raffreddato e spostare due microlitri di queste cellule su un vetrino sterile pre-raffreddato. Prendi una siringa da insulina preriempita dal ghiaccio e aspira lentamente i 2 microlitri di sospensione cellulare con lo smusso dell'ago rivolto verso il basso. Aprire il coperchio della capsula contenente l'organoide prima di focalizzare il microscopio su di esso.
Tenere il piatto con una mano, posizionare lo smusso dell'ago verso l'alto. E con l'altra mano, iniettare lentamente la cellula nella superficie dell'organoide. Dopo aver iniettato le cellule, riposizionare il coperchio nella capsula e incubare l'organoide iniettato per uno o due minuti.
Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno organoide alla piastra prima di trasferire l'organoide in una piastra a 24 pozzetti con una punta a foro largo. Incubare l'organoide a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con un cambio completo del terreno ogni due giorni. Caricare un organoide di controllo non iniettato o negativo in un microscopio a fluorescenza.
E imposta l'intensità dell'illuminazione tra 1 e 2 e il tempo di esposizione tra 80 e 100 millisecondi per un'autofluorescenza minima. Successivamente, caricare l'organoide di controllo positivo e aumentare il tempo di esposizione per garantire che le cellule marcate siano visibili. Riposizionare l'organoide con una punta della pipetta a foro largo per trovare la proteina fluorescente verde potenziata o la regione EGFP plus per l'iniezione.
Rimuovere completamente il terreno dall'organoide prima di caricare l'organoide. E immaginalo con le impostazioni selezionate. Una volta completata l'imaging, aggiungere immediatamente un terreno fresco per evitare che l'organoide si secchi.
Dopo aver ripetuto la rimozione del terreno e l'imaging per tutti gli organoidi, riportare gli organoidi alla normale incubazione e ai cambi di terreno. Ripetere l'imaging agli intervalli desiderati. Mettere il vetrino in un barattolo colorante per vetrini Coplin riempito di toluene per due minuti e ripetere questo passaggio.
Quindi, trasferire il vetrino in un barattolo di vetro Coplin riempito di alcol etilico al 100% per due minuti. E ripeti questo passaggio prima di trasferire il vetrino in un barattolo Coplin pieno d'acqua per due minuti. Ripetere il lavaggio con acqua.
Quindi, posizionare un contenitore di plastica nel bagnomaria, assicurandosi che la plastica non tocchi il fondo del bagno. Versare il tampone citrato all'interno del contenitore di plastica e lasciare che raggiunga i 95-100 gradi Celsius. Una volta che il tampone raggiunge la temperatura desiderata, posizionare i vetrini all'interno del tampone e coprire liberamente il contenitore con un coperchio, lasciando i vetrini all'interno del bagnomaria per 30-40 minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere il contenitore di plastica dal bagnomaria e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare i vetrini tre volte per due minuti ciascuno con PBS. Rimuovere il PBS con un fazzoletto di carta senza toccare il campione.
Preparare il tampone di permeabilizzazione e riempirlo con un barattolo di vetro per colorare. Immergere i vetrini nel tampone di permeabilizzazione e incubare per 10 minuti. Ripetere tre lavaggi di PBS per due minuti ciascuno.
Quindi, preparare la miscela colorante per coprire ogni campione e aggiungere 25 microlitri al vetrino organoide prima di incubare il vetrino a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, ripetere tre lavaggi di PBS per due minuti ciascuno e rimuovere i sali sciacquando il vetrino con acqua distillata all'interno di un barattolo di vetro per la colorazione. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di supporti liquidi e DAPI a ciascun campione prima di eseguire l'imaging del vetrino utilizzando il microscopio a fluorescenza.
Al barattolo di colorazione Coplin in vetro riempito a metà con tampone di tempra 2X, aggiungere 45 millilitri di PBS e posizionare i vetrini all'interno di questo barattolo. Incubare il barattolo per una notte a 4 gradi Celsius. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per verificare se i fluorofori sono stati effettivamente temprati prima di ripetere la colorazione e l'imaging.
Una chiara dipendenza dalla dose della fluorescenza GFP era presente sul numero di cellule in ingresso, con un rilevamento coerente di EGFP più patch cellulare a 10.000 cellule e oltre. Gli organoidi iniettati e i controlli sottoposti a imaging per la positività all'EGFP hanno mostrato la persistenza del sito iniettato durante il periodo di monitoraggio di quattro mesi. Ulteriori chiazze cellulari positive all'EGFP sono apparse nove giorni dopo il trapianto e sono persistite fino all'endpoint dello studio, indicando la migrazione delle cellule e l'integrazione nei loro nuovi siti.
A un ingrandimento più elevato, è stata osservata una chiara morfologia neurale con lunghe proiezioni nell'organoide, confermando l'integrazione delle cellule iniettate. La colorazione iniziale a singolo round ha confermato la presenza di cellule EGFP plus nel sito di iniezione, tra cui una miscela di cellule che mantengono lo stato NPC e quelle che si erano differenziate verso un destino neurale. Per il controllo e gli organoidi iniettati, sono stati osservati pochissimi Nestin più NPC, con una maggioranza di TUJ1 più neuroni maturi immaturi.
Le due colorazioni rotonde hanno fornito maggiori dettagli, rivelando neuroni maturi intorno alla maggior parte della regione esterna dell'organoide, con aree di neuroni immaturi verso il centro. Gli astrociti erano presenti negli organoidi iniettati e di controllo, ed erano sparpagliati intorno ai bordi esterni. La fetta per la quale è stata eseguita la colorazione a due tondi nell'organoide iniettato mostrava una piccola colonia satellite di cellule EGFP plus lontane dal sito di iniezione che avevano adottato il fenotipo dei neuroni maturi.
Alcune di queste colonie sembrano essere vicine agli astrociti. Tuttavia, nessuna cellula EGFP plus con sovrapposizione completa alla colorazione GFP ha suggerito che fossero adiacenti piuttosto che generare gli astrociti stessi. Quando si inietta l'organoide è necessario evitare di applicare troppa forza o di farlo troppo velocemente, in quanto si può distruggere completamente l'organoide.
Quindi, dopo il monitoraggio della vita, gli organoidi possono essere associati e utilizzati per l'analisi della citometria a flusso o per approcci di sequenziamento di singole cellule. Questo ci permetterà di conoscere lo stato molecolare delle cellule. Questa tecnica potrebbe essere estremamente utile per far progredire la terapia cellulare per le malattie neurodegenerative, anche per modellare tumori cerebrali o metastasi.
