Questo protocollo descrive come allevare vermi e compostare microcosmi, consentendo l'esplorazione in laboratorio delle interazioni ospite-microbioma in un contesto naturale. Questo metodo offre un'alternativa all'isolamento dei vermi selvatici dalla natura o all'utilizzo di comunità microbiche sintetiche di limitata diversità microbica. Questo protocollo è semplice e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio ed è adatto anche ai principianti.
Per iniziare, ottenere compost o terreno da giardino da qualsiasi fonte conveniente e conservarlo all'interno del laboratorio in un contenitore di plastica da cucina standard con fori tagliati nel coperchio per l'aerazione. Tappare i fori con cotone idrofilo per tenere fuori i moscerini della frutta e altri invertebrati. Arricchire il compost o il terreno con prodotti tritati o una miscela di prodotti diversi nel terreno per produrre un rapporto di due a uno in massa.
Mescolare il compost una volta al giorno e aggiungere M9 come richiesto per mantenere l'umidità senza renderlo fangoso. Per ogni microcosmo, aggiungere 10 grammi di compost arricchito in un becher di vetro da 30 millilitri ricoperto di carta stagnola. Aggiungere 30 grammi di compost arricchito a ciascun tubo da 50 millilitri.
Riempire il tubo con M9 e vortice. Centrifugare i tubi a 560 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere i surnatanti senza disturbare il pellet e combinarli in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Concentrare l'estratto batterico centrifugando il tubo alla massima velocità per 15 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in sufficiente M9 per avere 200 microlitri per ogni microcosmo e 200 microlitri per una piastra che servirà come proxy visibile per i microcosmi. Aggiungere 200 microlitri di estratto microbico concentrato al becher di compost autoclavato e alla piastra NGM proxy visibile.
Aggiungi da 500 a 1000 larve di L1 a ciascun microcosmo e alla piastra proxy. Foderare un tubo cilindrico in PVC con carta velina. Questo cilindro dovrebbe avere una rete di nylon di un millimetro incollata sul fondo nell'imbuto.
Posizionare il cilindro nell'imbuto Baermann seduto in un pallone. Aggiungi 20 millilitri di M9 al microcosmo del verme. Agitare la miscela e quindi versare la miscela dal becher nel cilindro rivestito di carta velina nella configurazione dell'imbuto Baermann.
Immergere completamente il compost nell'imbuto aggiungendo più M9. Sganciare il morsetto per rilasciare il filtrato contenente i vermi raccolti in un tubo da 50 millilitri. Quindi concentrare i vermi centrifugando il tubo a 560 G per due minuti a temperatura ambiente. Ripetere questi passaggi e tirare i filtrati da diversi round se si desidera più vermi.
Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica lasciando 15 millilitri nel tubo. Trasferire il liquido rimanente in un tubo da 15 millilitri e centrifugare nuovamente per un minuto per concentrare ulteriormente i vermi. Rimuovere 14 millilitri di surnatante con una pipetta sierologica.
Allo stesso tempo, raccogliere un grammo del terreno del microcosmo rimanente in un tubo da 1,5 millilitri mentre si elaborano i campioni di terreno contenenti la comunità batterica ambientale come descritto nel manoscritto. Trasferire un millilitro dei vermi raccolti concentrati in un tubo da 1,5 millilitri usando una pipetta di vetro. Incubare per due minuti per consentire ai vermi di depositarsi sul fondo del tubo.
Rimuovere il surnatante lasciando indisturbati 100 microlitri di pellet sul fondo del tubo. Lavare il pellet con 1,5 millilitri di M9 più Triton X, lasciando che i vermi si depositino sul fondo ogni volta. Trasferire i vermi lavati in un volume di 100 microlitri in un nuovo tubo da 1,5 millilitri usando una pipetta di vetro.
Per paralizzare i vermi, aggiungere 100 microlitri di levaso cloridrato da 25 millimolari e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di candeggina al 4% e incubare per due minuti. Rimuovere il surnatante lasciando indisturbati i 150 microlitri più bassi e lavare il pellet di verme tre volte con M9 più Triton X.Questi vermi sterilizzati in superficie possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino all'uso e possono essere utilizzati successivamente per applicazioni a valle.
Il confronto tra i microbiomi intestinali dei vermi e le comunità ambientali utilizzando l'analisi delle coordinate principali basata sulla distanza UniFrac non ponderata o ponderata ha mostrato un distinto raggruppamento dei microbiomi intestinali dei vermi lontano da quelli nei rispettivi ambienti. Mentre l'analisi delle coordinate principali basata su distanze UniFrac non ponderate non distingueva tra microbiomi del suolo e dei vermi, il raggruppamento basato su distanze ponderate ha rivelato una chiara separazione dei microbiomi dell'intestino del verme e del compost. In questo studio, i vermi allevati in microcosmi di compost sono stati utilizzati per il sequenziamento 16S, ma possono anche essere utilizzati per testare gli effetti di diversi microbiomi ambientali sulla resistenza dell'ospite a condizioni avverse.
In alternativa, nuovi taxa batterici possono essere isolati da vermi raccolti da microcosmi di compost al fine di espandere la nota diversità tassonomica e funzionale dei commensali intestinali dei vermi. Dopo il suo sviluppo, la pipeline dei microcosmi ha facilitato la valutazione dei contributi dei fattori genetici ambientali rispetto a quelli dell'ospite nel modellare il microbioma intestinale.
