Descritto in questo video è un protocollo per la creazione e l'utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco noto come Drydux che promuove efficacemente la trasduzione delle cellule T attivate. Drydux è progettato per essere utilizzato al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite con RetroNectin seminate con virus e semplifica il processo di trasduzione delle cellule. Drydux ha un'efficienza di trasduzione paragonabile alla spinoculazione su piastre rivestite con RetroNectin e rappresenta un'alternativa più economica e conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.
In primo luogo, preparare una soluzione allo 0,4% di calcio-D-gluconato. Aggiungere acqua DI filtrata sterile al calcio-D-gluconato in un becher. Mescolare a velocità media fino a quando il calcio-D-gluconato si è sciolto, il che richiede circa 1 1/2 ore.
Una volta sciolto, filtrare sterile la soluzione di calcio-D-gluconato. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente. Quindi, preparare una soluzione di alginato al 2%.
Questo può essere realizzato utilizzando una fiala con tappo a vite o un becher. Entrambi saranno mostrati qui. Aggiungere con attenzione l'alginato ultrapuro al recipiente.
Aggiungere la quantità appropriata di acqua DI all'alginato. Scegli il più grande agitatore possibile che non impedisca la miscelazione e aggiungilo al recipiente. Mescolare la soluzione in alto fino a quando l'alginato si scioglie, il che richiede circa un'ora.
Se ci sono grandi ciuffi di alginato sul lato della nave, inclinare la nave lateralmente per spostarli. Piccoli grumi si dissolveranno nel corso dell'ora e non sono motivo di preoccupazione. Una volta che la soluzione di alginato al 2% si scioglie, ridurre la velocità di agitazione.
Aggiungere lentamente un volume uguale della soluzione di calcio-D-gluconato alla soluzione di alginato. Aggiungerlo lentamente aiuterà a prevenire la formazione di grumi di reticolazione. Quando la soluzione di calcio-gluconato è stata aggiunta, aumentare la velocità di agitazione e mescolare vigorosamente per 15 minuti.
Inclinare la nave lateralmente per rimuovere eventuali grumi che potrebbero essersi formati. Dopo aver agitato vigorosamente per 15 minuti, assicurarsi che non ci siano grumi nella soluzione. Pipettare la soluzione in una piastra da 48 o 24 pozzetti.
Per una piastra da 48 pozzetti, pipettare 300 microlitri in ciascun pozzetto. Assicurarsi di lanciare lentamente e cambiare spesso le punte, poiché la soluzione sarà viscosa e potrebbe attaccarsi alla punta. Per una piastra da 24 pozzetti, pipettare un millilitro in ciascun pozzetto.
Anche in questo caso, lanciare lentamente e cambiare spesso le punte delle pipette. Coprire le piastre del pozzo con un coperchio e congelare a 20 gradi Celsius negativi durante la notte. Preparare i piatti per il liofilizzante rimuovendo i coperchi e fissando la parte superiore con salviette e elastici.
Posizionare le piastre nel tubo del liofilizzatore e indossare il liofilizzatore per 72 ore. Dopo 72 ore, rimuovere la piastra dal liofilizzatore. Gli scaffold sono ora pronti per essere utilizzati per la trasduzione.
Se non si utilizzano immediatamente i ponteggi, sigillare la piastra con Parafilm e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di sigillare sottovuoto la piastra oltre alla sigillatura con Parafilm. Concentrare il surnatante virale centrifugando due millilitri di soluzione virale attraverso un filtro centrifugo a 1.500 g per 10 minuti.
Sono necessari da 100 a 200 microlitri di virus concentrato per impalcatura. Ruotare per qualche minuto aggiuntivo se il volume della soluzione virale concentrata è superiore a 200 microlitri. Per ogni impalcatura, fare un'aliquota di 1 milione di cellule T attivate sospese in 50 microlitri di terreno di coltura cellulare completo.
Aggiungere il virus concentrato alla sospensione cellulare. Il volume totale della sospensione del virus cellulare non deve superare i 200 microlitri per uno scaffold a 48 pozzetti o 350 microlitri per uno scaffold a 24 pozzetti. Aggiungere la miscela di virus cellulare goccia a goccia nella parte superiore dell'impalcatura asciutta.
Per gli esperimenti di controllo negativo, utilizzare terreni di coltura cellulare completi al posto del virus concentrato. Aggiungere questa sospensione cellulare nella parte superiore dell'impalcatura asciutta. Incubare gli scaffold nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.
Rimuovere i ponteggi dall'incubatore. Gli scaffold dovrebbero assorbire completamente la soluzione durante questo periodo. Per indurre la proliferazione, aggiungere terreni di coltura cellulare completi integrati con IL-7 e IL-15 a ciascun pozzetto.
IL-2 può anche essere usato. Per un'impalcatura a 24 pozzetti, aggiungere un millilitro. Per un'impalcatura da 48 pozzetti, aggiungere 500 microlitri.
Incubare a 37 gradi Celsius per 72 ore. Le cellule proliferano nel corso delle 72 ore, il che può trasformare il mezzo in arancione. Rimuovere i supporti in eccesso da ciascun pozzetto.
Per isolare le cellule dallo scaffold, aggiungere una soluzione di EDTA molare 0,25 a ciascuna impalcatura. Aggiungere un millilitro per scaffold da 24 pozzetti o 300 microlitri per scaffold da 48 pozzetti. Lasciare riposare il piatto o agitare delicatamente per tre o quattro minuti.
Una volta per lo più sciolto, pipettare dentro e fuori delicatamente all'interno del pozzetto. Potrebbero essere necessari alcuni passaggi di pipettaggio in entrata e in uscita per dissolvere completamente lo scaffold. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Lavare le celle due volte con PBS. Aggiungere 12 millilitri di PBS a ciascuna provetta da centrifuga. Centrifugare a 400 g per cinque minuti.
Un pellet cellulare si formerà sul fondo del tubo. Aspirare la soluzione surnatante e ripetere il lavaggio. Fare attenzione a rimuovere completamente il surnatante ad ogni lavaggio in quanto è fondamentale eliminare tutto l'EDTA.
Dopo il lavaggio con PBS una seconda volta, il pellet cellulare è pronto per l'analisi. La citometria a flusso è stata utilizzata per determinare l'efficienza di trasduzione di ciascun gruppo. Le cellule non trasdotte sono state utilizzate come controllo negativo e non hanno mostrato trasduzione.
Anche le cellule seminate su scaffold senza retrovirus GFP non hanno mostrato trasduzione. Il gruppo Drydux, che aveva attivato cellule seminate sugli scaffold di alginato macroporoso secco, ha mostrato una trasduzione dell'85%, appena inferiore al gruppo Retronectin. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di Drydux trasducono efficacemente le cellule mediante trasferimento genico retrovirale senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di RetroNectin.
Gli scaffold Drydux mostrano un'elevata efficienza di trasduzione paragonabile a RetroNectin, fornendo un metodo alternativo per la trasduzione delle cellule T. A causa del basso costo di produzione degli scaffold Drydux, questo processo ha il potenziale per ridurre significativamente il costo delle terapie con cellule T CAR.
