Trovare trattamenti per il glioblastoma è difficile a causa della diversità cellulare che esiste nei tumori e delle interazioni tra diversi microambienti. Gli organoidi possono aiutare a ricreare parte di quella diversità spaziale e possiamo usarla per comprendere meglio la biologia dei tumori. Mentre i metodi tradizionali di coltura cellulare tendono a produrre popolazioni omogenee di cellule tumorali, gli organoidi possono imitare meglio la diversità molecolare e cellulare del glioblastoma e modellare meglio le interazioni intratumorali.
Gli organoidi possono essere utilizzati per studiare l'efficacia dei farmaci e i meccanismi di resistenza. La resistenza alle terapie cliniche può apparire solo negli organoidi e non nella cultura della sfera tradizionale, riflettendo la realtà clinica di questa malattia. Gli organoidi possono aiutare a dimostrare gli effetti regionali delle chemioterapie.
Possono essere utilizzati per scoprire nuove terapie specifiche di nicchia e possono anche fungere da strumento predittivo per la medicina personalizzata in futuro. Alcuni materiali utilizzati per creare organoidi sono sensibili alla temperatura e trascurare di mantenere questi materiali alla loro giusta temperatura può portare a difficoltà nella creazione o nella manutenzione degli organoidi. Inizia a preparare gli stampi organoidi sotto un cappuccio di coltura togliendo la carta cerata dal foglio di parafilm e posizionandola tra due sterili 96 pozzetti di reazione a catena della polimerasi o piastre PCR.
Assicurarsi che l'interno del parafilm sia pulito. Applicare una pressione uniforme sulla piastra superiore per formare piccole fossette profonde due millimetri nel parafilm senza creare fori. Separare i piatti.
Il parafilm a fossette si attaccherà alla piastra superiore. Quindi posizionare la piastra superiore su ghiaccio secco per 30 secondi. Utilizzare una pinza sterile per estrarre il parafilm dalla piastra superiore con un movimento rapido.
Il parafilm congelato è più facile da rimuovere. Posizionare lo stampo per parafilm completato in un piatto di coltura cellulare sterile coperto e sterile da 10 centimetri. Per preparare la sospensione unicellulare da glioblastoma o coltura aderente GBM, rimuovere il mezzo utilizzato dalla piastra.
Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di distacco cellulare a temperatura ambiente alla piastra e incubare la piastra a 37 gradi per tre minuti. Dopo aver confermato il distacco cellulare dalla piastra al microscopio, aggiungere otto millilitri di mezzo neurobasale completo, o mezzo NBMc, per neutralizzare la soluzione di distacco cellulare. Filtrare la sospensione attraverso un singolo filtro a celle da 70 micron.
Ruotare le celle a 120 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di NBMc. Contare le cellule dalla sospensione a cella singola usando una macchia imper-media cellulare.
Per produrre organoidi da una sospensione unicellulare, aggiungere una quantità appropriata di matrice extracellulare ricca di laminina, o lrECM, in un piccolo tubo di centrifuga in un secchiello del ghiaccio o in un blocco freddo. Preparare una miscela cellulare contenente 20.000 cellule per organoide. Mescolare accuratamente la miscela di sospensione cellulare lrECM per evitare di depositare le cellule, che si tradurrebbe in una formazione organoide non uniforme.
Quindi, pipettare accuratamente 20 microlitri della miscela su uno stampo parafilm per formare una goccia simile a una perla. Assicurarsi di raffreddare la punta della pipetta ogni due o tre organoidi per evitare la polimerizzazione di lrECM. Una volta che il numero desiderato di organoidi viene pipettato sullo stampo del parafilm in una piastra di coltura di 10 centimetri, incubare gli organoidi a 37 gradi Celsius per una o due ore in un incubatore di coltura cellulare.
Dopo che gli organoidi sono solidificati, lavare delicatamente gli organoidi dallo stampo del parafilm con il mezzo NBMc usando una punta P1000 e raccoglierli in una nuova piastra di coltura da 10 centimetri contenente 20 millilitri di NBMc. Posizionare la piastra di coltura in un'incubatrice senza agitare per quattro giorni. Dopo quattro giorni, sostituire il supporto nella piastra.
Per fare questo, posizionare un pezzo di carta scura sotto la piastra di coltura cellulare. Inclinare la piastra e attendere 20 secondi. Mentre gli organoidi si depositano completamente sul fondo del piatto, rimuovere lentamente il supporto con una pipetta di vetro ad apertura grande.
Dopo aver aggiunto nuovi supporti, posizionare la piastra nell'incubatore su uno shaker orbitale a 80 RPM e successivamente scambiare il fluido ogni due o tre giorni. La crescita dell'organoide è stata osservata utilizzando la microscopia ottica. Nella vista centrale, la crescita precoce degli organoidi ha mostrato migrazione e invasione di singole cellule attraverso lrECM.
Gli organoidi maturi a sette settimane erano relativi alle dimensioni di un centesimo. La colorazione immunoistochimica degli organoidi GBM con fosfo-istone H3 ha rivelato cellule altamente proliferative con un aspetto marrone o viola nel perimetro organoide rispetto al nucleo. I dati di vitalità cellulare per organoidi nello 0,1% di DMSO hanno dimostrato la consistenza intraorganoide e interorganoide.
Prestare attenzione alla biomassa organoide e all'acidificazione dei mezzi. Se gli organoidi attraversano i terreni troppo rapidamente, assicurarsi di scambiare i terreni più frequentemente o dividere gli organoidi tra piastre aggiuntive. Gli organoidi maturi possono essere utilizzati per esperimenti con terapie o incorporati e sezionati per l'uso con immunoistochimica o immunofluorescenza.
Gli organoidi dissociati possono essere utilizzati per l'analisi FACS. Questi organoidi sono stati recentemente utilizzati nello screening funzionale tridimensionale per scoprire bersagli essenziali in nicchie spazialmente distinte di cellule staminali tumorali. Stiamo anche usando questi modelli per dare priorità a diversi farmaci e terapie prima dei test in vivo.
