Questo è il primo rapporto che dimostra che l'iniezione intramiocardica percutanea guidata dall'ecocardiografia dei cardiomiociti migliora significativamente la proprietà riparativa dei cardiomiociti umani derivati da iPS. Questo metodo è fattibile, soddisfacente, ripetibile, meno invasivo ed efficace procedura per la somministrazione di cardiomiociti umani derivati da iPS. Riteniamo che la somministrazione intramiocardica percutanea sia un metodo sicuro ed efficiente per la somministrazione locale di farmaci per malattie tra cui cardiopatia ischemica, infarto miocardico e insufficienza cardiaca.
Questo progetto è supervisionato dal professor Jinfu Yang e dal professor Jun Peng. A dimostrare la procedura saranno Xun Wu, Kele Qin e Kun Xiang, MD PhDs dal mio laboratorio e Di Wang, un dottorato di ricerca dal laboratorio chiave provinciale di Hunan di ricerca cardiovascolare. Per iniziare, aspirare sottovuoto il surnatante di coltura da una coltura di 60 giorni di hiPSC-CMs.
Lavare le cellule con PBS tre volte. Quindi dissociare gli hiPSC-CM in singole cellule usando la miscela enzimatica di distacco cellulare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Raccogliere le celle in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI più B27 mezzo e mescolare.
Contare le celle e calcolare il numero totale di celle. Centrifugare la sospensione cellulare a 300G per due minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo di supporto dei cardiomiociti ad una concentrazione di 6 x 10 delle 4 cellule per microlitro.
Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius fino alla fase di iniezione. Dopo che il mouse è sufficientemente anestetizzato, fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo. Quindi, fissare gli incisivi del mouse con un filo di seta 2/0 e del nastro adesivo.
Sterilizzare il collo mediano e il torace sinistro con tre cicli alternati di betaina seguiti da alcol. Fai un'incisione mediana del collo usando forbici anatomiche sottili e pinze da dissezione fine. Tagliare alcuni muscoli cervicali anteriori per stabilizzare ed esporre completamente la trachea.
Inserire un ago per puntura del catetere di calibro 20 come tubo tracheale attraverso la bocca. Collegare il tubo tracheale al ventilatore e controllare il movimento toracico per assicurarsi che entrambi i polmoni siano ben ventilati. Regola i parametri respiratori.
Quindi, rifissare l'arto posteriore sinistro sul lato inferiore destro e allentare il nastro attorno all'arto superiore sinistro. Con sottili forbici e pinze da dissezione, eseguire una toracotomia nello spazio intercostale da tre a quattro del torace sinistro. Usando una pinza, staccare il pericardio e individuare l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra.
Utilizzare un filo di seta 6/0 per legare l'estremità prossimale dell'arteria. Per garantire che il modello di infarto miocardico acuto sia stabilito, attendere che il lato distale dell'arteria nel sito di legatura cambi da rosso a bianco. Chiudere il torace strato per strato e suturare la pelle con filo 4/0.
Per il gruppo fittizio di animali, eseguire tutte le procedure chirurgiche ad eccezione della legatura. Nelle prime due settimane dopo l'infarto miocardico, posizionare i topi in una scatola per anestesia collegata con isofluorano al 5% ed eseguire l'intubazione tracheale. Tre giorni prima della somministrazione di hiPSC-CMs, iniettare ciclosporina A nella cavità intraperitoneale alla dose di 10 milligrammi per chilogrammo al giorno.
Rimuovere i peli dal petto e dall'addome superiore del topo con crema depilatoria. Inalazione di alimentazione isofluorano fino a quando la frequenza cardiaca è mantenuta a 400 a 500 battiti al minuto. Fissare gli arti e la coda del mouse con del nastro adesivo sulla console di rilevamento e impostare la temperatura della piattaforma a 37 gradi Celsius.
Applicare la gelatina ad ultrasuoni sulla parte superiore dell'addome. Utilizzando una sonda ecografica veterinaria ad alta risoluzione, ottenere immagini del fegato del topo. Utilizzando una micro siringa da cinque microlitri, aspirare circa 3 x 10 al 5 ° hiPSC-CMs.
Tenere la siringa e inserire un ago da tre millimetri nel processo paraxifoideo sinistro. Sotto guida ecografica, seguire il bordo superiore del diaframma. Osservare il ritmo respiratorio e la gamma.
Entra nel pericardio alla fine del cerchio espiratorio, evitando danni al fegato e ai polmoni. Quindi acquisire l'immagine dell'asse lungo parasternale del cuore del topo mediante ecocardiografia in modalità B. Sotto guida ultrasonica, iniettare 1 x 10 alle cellule 5th hiPSC-CMs in ciascuna delle tre aree marginali del sito di infarto.
Rimuovere la sonda ad ultrasuoni e risciacquare la gelatina. Svezzare il topo dall'anestesia e riportarlo nella sua gabbia. Iniettare ciclosporina A continuamente per un mese dopo il trapianto.
L'ecocardiogramma del ventricolo sinistro ha mostrato che le lesioni dovute all'infarto miocardico sono state invertite nel gruppo a dosi multiple. Il trapianto di hiPSC-CMs ha anche comportato un aumento della frazione di eiezione e un accorciamento della frazione. La misurazione dei parametri cardiaci utilizzando la colorazione Sirius Red e Fast Green ha mostrato che la dimensione dell'infarto e la frazione di volume del collagene sono diminuite, mentre lo spessore della parete anteriore ventricolare sinistra è aumentato dopo il trapianto.
L'etichettatura per l'alfa actina non specifica in verde, DAPI in blu e troponina T specifica per l'uomo in rosso ha mostrato la presenza di cellule trapiantate nell'infarto e nell'area marginale dell'infarto. Il numero e la percentuale di cellule trapiantate erano più alti nel gruppo a dose multipla rispetto alla dose singola. 28 giorni dopo l'infarto miocardico, il gruppo a dosi multiple ha mostrato un aumento del numero di cellule che esprimono il marcatore delle cellule endoteliali, I-B4.
L'agglutinina del germe di grano e la colorazione dell'alfa actinina sarcomerica sui cardiomiociti hanno mostrato una riduzione del diametro minimo della fibra. Un numero inferiore di nuclei di cardiomiociti positivi al tunnel nel gruppo a dose multipla ha indicato una riduzione dell'apoptosi. L'analisi PCR ha rilevato il DNA mitocondriale umano solo nel cuore, mostrando un trapianto specifico.
Quando si inserisce l'ago, assicurarsi che entri nella cavità pericardica insieme al margine superiore del diaframma e alla fine del cerchio espiratorio per evitare lesioni al fegato o al polmone.
