Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è una proteina motoria bidirezionale. Cin8 si muove nella direzione meno dei microtubuli come una singola molecola e cambia la direzionalità in una serie di diverse condizioni sperimentali. L'obiettivo generale della nostra ricerca è comprendere il meccanismo della motilità bidirezionale studiando i fattori e gli elementi strutturali che regolano la motilità bidirezionale di Cin8.
Questo protocollo spiega in modo completo la purificazione del Cin8 a lunghezza intera di tipo GFP sovraespresso nelle cellule di lievito, il test di motilità a singola molecola e la successiva analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8. Questa separazione è importante, poiché la direzionalità di Cin8 è influenzata dal suo accumulo in cluster sul microtubulo. Questa tecnica può essere facilmente adattata per purificare altre proteine nucleari dal lievito.
Inoltre, può essere applicato a qualsiasi particella fluorescente che deve essere separata in gruppi di dimensioni in base alla loro intensità di fluorescenza. A dimostrare la procedura saranno la dott.ssa Mary Popov, la nostra responsabile di laboratorio, la dott.ssa Alina Goldstein-Levitin, e la dott.ssa Nurit Siegler, borsisti post-dottorato; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan e Shira Hershfinkel, studenti laureati; e Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham e Meital Haberman, studenti universitari del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule di Saccharomyces cerevisiae contenenti il plasmide per la sovraespressione di Cin8-GFP-6È alla fase di crescita esponenziale in un litro di mezzo selettivo del lievito, integrato con il 2% di raffinosio a 28 gradi Celsius.
Quindi indurre Cin8-GFP-6La sua sovraespressione aggiungendo il 2% di galattosio e monitorare la crescita della coltura del lievito misurando l'assorbanza a 600 nanometri. Cinque ore dopo l'aggiunta di galattosio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Sospendere nuovamente le cellule nel tampone di lisi e congelarle in azoto liquido.
Successivamente, usando un mortaio refrigerato e un pestello, macinare le cellule congelate in azoto liquido. Continuare ad aggiungere azoto liquido durante la macinazione, in modo che gli estratti rimangano congelati. Monitorare la lisi cellulare al microscopio a contrasto di fase o a interferenza differenziale.
Quindi scongelare le cellule di terra e centrifugarle. Caricare il surnatante su una colonna a flusso gravitazionale riempita con due millilitri di Nichel-NTA e preequilibrarlo con tampone di lisi. Lascia che il surnatante fluisca attraverso la colonna.
Lavare la colonna con cinque volumi di colonna di tampone di lisi, seguiti da cinque volumi di colonna di tampone di lisi integrati con imidazolo 25 millimolare. Quindi eluire il Cin8-GFP-6His con tampone di eluizione. Analizzare i campioni eluiti mediante frazionamento SDS-PAGE, seguito dalla colorazione blu Coomassie e dall'analisi Western blot sondata con anticorpi anti-GFP.
Dopo aver raggruppato le frazioni contenenti Cin8-GFP-6His, purificarle mediante cromatografia ad esclusione dimensionale ad una portata di 0,5 millilitri al minuto e un limite di pressione della colonna di 1,5 megapascal. Monitorare contemporaneamente l'assorbanza a 280 nanometri. Raccogliere le frazioni corrispondenti al tetramero Cin8-GFP e analizzarle mediante SDS-PAGE e Western blotting.
Quindi aliquotare le frazioni selezionate, congelare a scatto e conservare fino all'uso a meno 80 gradi Celsius. Per polimerizzare e stabilizzare i microtubuli marcati con biotina e rodamina, mescolare i componenti della reazione in un tubo da 1,5 millilitri e incubare la miscela per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere 80 microlitri di tampone tubulinico generale caldo, mescolare con cura e centrifugare.
Scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet con attenzione pipettando su e giù con 50 microlitri di tampone tubulinico generale caldo. Quindi conservare la sospensione a 28 o 37 gradi Celsius. Esaminare i microtubuli con un microscopio a fluorescenza, utilizzando il canale della rodamina a 647 nanometri.
Quindi, rimuovere la carta protettiva dalle strisce di nastro e posizionare una coverslip sillanizzata sulle strisce per creare tre camere di flusso volumetrico da 10 microlitri. Quindi eseguire il rivestimento avidin del coverslip mediante aggiunta sequenziale dei reagenti indicati. Incubare il coverslip per tre o cinque minuti prima di lavarlo con 80 microlitri di tampone tubulinico generale.
Quindi, collegare i microtubuli biotinilati ai coperchi rivestiti di b-BSA / avidina inserendo 20 microlitri di microtubuli nella camera di flusso. Incubare le diapositive con il coperchio rivolto verso il basso in una camera di umidità buia per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le diapositive con 200 microlitri di tampone tubulinico generale.
Successivamente, applicare 30 microlitri di miscela di reazione di motilità seguiti da motori Cin8-GFP diluiti in 20 microlitri della miscela di reazione di motilità nella camera di flusso e procedere immediatamente all'immagine del movimento dei motori lungo i microtubuli. Per l'imaging della motilità motoria, posizionare una goccia di olio di immersione sull'obiettivo del microscopio, quindi posizionare la camera di flusso sullo stadio del microscopio fluorescente, con il coperchio rivolto verso l'obiettivo. Accendere il canale della rodamina per concentrarsi sui microtubuli attaccati alla superficie del coverslip.
Quindi, utilizzando il software ImageJ Micro-Manager, acquisire l'immagine con un'esposizione di 20 millisecondi. Quindi, attiva il canale GFP e acquisisci 90 immagini time-lapse con un intervallo di un secondo e un'esposizione di 800 millisecondi. Nel software ImageJ Fiji, aprire il filmato time-lapse e l'immagine del campo microtubulico corrispondente.
Sincronizzare queste due finestre scegliendo Analizza, quindi Strumenti e Sincronizza finestre. Per ottenere un kymograph, evidenziare un microtubulo utilizzando l'opzione Linea segmentata. Quindi, da Analizza, selezionare la scheda Multi Kymograph.
Per determinare la dimensione del cluster delle molecole Cin8-GFP, eseguire la sottrazione e la correzione dello sfondo per un'illuminazione irregolare facendo clic su Processo, quindi su Sottrai sfondo. Impostate il raggio della sfera di rotolamento su 100 pixel e selezionate l'opzione Paraboloide scorrevole. Quindi traccia uno specifico motore Cin8-GFP non mobile utilizzando il plug-in TrackMate del software ImageJ Fiji.
Scegli Plugin, seguito da Tracking, TrackMate, Rilevatore LoG e Tracker LAP semplice per seguire l'intensità media di fluorescenza del motore Cin8-GFP in funzione del tempo all'interno di un cerchio di quattro pixel di raggio. Dopo aver ripetuto la procedura per diversi motori Cin8-GFP, tracciare le intensità di fluorescenza in funzione del tempo. Successivamente, per tracciare la motilità delle molecole Cin8-GFP lungo le tracce dei microtubuli, ritaglia i microtubuli da analizzare nella sequenza time-lapse dei fotogrammi registrati evidenziandolo con lo strumento rettangolo e facendo clic su Immagine, seguito da Ritaglia.
Scegli una particella fluorescente Cin8-GFP per l'analisi. Registrate le coordinate delle particelle in ogni fotogramma della sequenza time-lapse utilizzando lo strumento punto e le opzioni Misura. Allo stesso modo, registrare le coordinate per altre particelle fluorescenti nella sequenza time-lapse.
Quindi assegnare la dimensione del cluster a tutte le particelle Cin8-GFP esaminate nel primo fotogramma del loro aspetto, come dimostrato in precedenza. Successivamente, utilizzando la formula indicata e le coordinate di movimento Cin8-GFP determinate, calcolare gli spostamenti di Cin8-GFP in ogni punto temporale rispetto alle coordinate iniziali. Da questi valori di spostamento, calcolare lo spostamento per tutti i possibili intervalli di tempo per una particella Cin8-GFP specificata.
Ripetere la procedura per tutte le particelle Cin8-GFP esaminate. Infine, traccia lo spostamento medio di tutte le particelle Cin8-GFP esaminate rispetto all'intervallo di tempo e sottoponilo a un adattamento lineare. La pendenza di questo adattamento rappresenta la velocità media delle particelle cin8-GFP mobili.
Le caratteristiche di motilità della proteina motoria bidirezionale Cin8 di diverse dimensioni di cluster su singoli microtubuli sono mostrate qui. Per ogni categoria di dimensioni del cluster, dalle registrazioni sono state estratte più di 40 traiettorie di singoli Cin8-GFP. Tracciare gli spostamenti medi di singole molecole e cluster di motori Cin8 in funzione dell'intervallo di tempo ha dimostrato che le singole molecole Cin8-GFP si muovono in modo unidirezionale diretto verso la fine inferiore con alta velocità.
Al contrario, gli ammassi Cin8 mostrano una velocità inferiore e una motilità bidirezionale più elevata. Durante l'esecuzione di questa procedura, è necessario utilizzare proteine motorie ad alta purezza per evitare contaminazioni che possono influire sul clustering motorio. Nell'analizzare l'intensità di fluorescenza del motore, è importante esaminare i motori nel primo fotogramma in cui appaiono, per evitare l'effetto del fotosbiancamento.
Quando si studia la motilità dei motori bidirezionali, è estremamente importante analizzare separatamente singole molecole e cluster, poiché il clustering motorio è uno dei fattori chiave che influenzano la direzionalità del motore.
