Il riflesso H consente la validazione elettrofisiologica dell'integrità dei neurocircuiti. Presentiamo un protocollo terminale per quantificare il riflesso H direttamente ai nervi della zampa anteriore nei topi. A differenza delle registrazioni transcutanee convenzionali piuttosto nervose, i risultati sono meno variabili tra topi e giorni di misurazione.
Simile alle registrazioni H-reflex nei pazienti, poiché la quantificazione precisa consente la caratterizzazione elettrofisiologica in modelli di malattia, ad esempio lesioni del midollo spinale e ictus. Il protocollo richiede solide competenze sperimentali nel lavorare con le apparecchiature chirurgiche nei topi.
Se non sei sicuro di come separare i nervi dal tessuto connettivo e dai vasi sanguigni, pratica prima. A dimostrare la procedura sarà Frederique Wieters, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, posizionare il topo adulto anestetizzato C57 nero/6J di età compresa tra 8 e 16 settimane sul termoforo coperto e attendere che il topo sia calmo, la respirazione sia stabile e i riflessi siano assenti.
Gira il mouse sul dorso. Quindi, fissare le zampe anteriori con del nastro adesivo. Posizionare il nastro in modo tale che gli elettrodi di misurazione siano facilmente inseriti nelle zampe anteriori.
Per misurare la temperatura di un mouse inserire una sonda rettale e fissarla con del nastro adesivo. Applicare un unguento per gli occhi per evitare che gli occhi si secchino. Rimuovere accuratamente la pelliccia con un paio di forbici sottili e arrotondate mentre si solleva la pelle con una pinzetta.
Successivamente, fai un'incisione di un centimetro nella pelle lungo l'asse ventroposteriore della zampa anteriore con un paio di forbici sottili e arrotondate. Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo ed esporre il muscolo e il nervo sottostanti. Quindi rimuovere il muscolo pettorale profondo esposto usando una pinza per valutare il nervo mediano.
Rimuovere piccole quantità di sangue e fluido tissutale con carta da tessuto molle. Quindi, tagliare con cura il seno o il muscolo ascellare dall'alto verso il basso per esporre il fascio nervoso. Liberare il fascio nervoso dal tessuto connettivo e muscolare per una lunghezza di circa 1,5 centimetri.
Separare attentamente il nervo ulnare e mediano della zampa anteriore usando una pipetta di vetro piegata. Il nervo superiore è il nervo ulnare e il nervo inferiore è il nervo mediano. Disporre gli elettrodi del gancio dello stimolatore in parallelo a una distanza da 0,5 a un millimetro e utilizzare un micromanipolatore per posizionare il doppio gancio vicino al nervo.
Utilizzare il gancio di vetro per sollevare il nervo ulnare sugli elettrodi del gancio di stimolazione. Quindi, tirare indietro l'elettrodo con il nervo e separarlo dagli altri nervi. Posizionare gli elettrodi lungo l'asse lungo della zampa per ridurre la diafonia tra i muscoli.
Asciugare superficialmente i ganci degli elettrodi attaccati al nervo e applicare vaselina usando una siringa per fornire isolamento elettrico dal tessuto adiacente. Per misurare il riflesso H, posizionare gli elettrodi elettromiografici per via intramuscolare nella zampa anteriore. Quindi, posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea nell'arto posteriore, tenuto da una clip a coccodrillo in miniatura.
Quando lo stimolatore è acceso, osservare una stimolazione riuscita come piccole contrazioni della zampa anteriore. La corrente minima di stimolazione per suscitare l'onda M e le piccole contrazioni visibili nella zampa anteriore sono comprese tra 10 e 50 microampere. Eseguire la stimolazione nervosa 15 volte con impulsi lunghi 0,2 millisecondi ciascuno.
Con pause di due minuti tra i set di stimoli, la frequenza viene aumentata da 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 a 5 hertz. Un'illustrazione della registrazione impostata nei percorsi per misurare il riflesso di Hoffman e la risposta muscolare è mostrata qui. È stato valutato il rapporto tra l'ampiezza dell'onda H e M.
Lo stimolo e il rispettivo artefatto di stimolazione sono stati impostati a zero millisecondi, seguiti dall'onda M diretta e dal successivo picco più piccolo che rappresenta l'onda H. L'onda M si verifica circa due millisecondi dopo la stimolazione e l'onda H dopo sei-otto millisecondi a causa del tempo di transito più lungo attraverso il midollo spinale. Accanto alla separazione dei nervi, l'applicazione della vaselina all'elettrodo e anche tra i due ganci è fondamentale.
Questo è un esperimento terminale. Nel nostro laboratorio, questa tecnica ha fornito un nuovo riferimento gold standard per le registrazioni transcutanee del riflesso H.
