Presentiamo un protocollo per la visualizzazione al microscopio elettronico dei domini replicativi nella cellula mediante l'etichettatura EdU del DNA appena sintetizzato e il rilevamento dell'etichetta con potenziamento dell'argento delle particelle Nanogold e colorazione ChromEM della cromatina. Questo protocollo fornisce l'etichettatura pre-incorporamento ad alto contrasto con la tradizionale fissazione della glutaraldeide che offre la migliore conservazione strutturale della cromatina per l'elaborazione del campione a temperatura ambiente. Questo protocollo è ottimizzato per la cellula di aderenza che cresce sui coverslip nella capsula di Petri.
Aggiungere EdU a 10 micro moli concentrazione finale e posizionare le cellule nell'incubatore per il tempo di etichettatura desiderato. Fissare le cellule etichettate con gluaradeidrato al 2,5% in una soluzione di cacodilato di sodio da 100 millimoli per un'ora. Un tempo di fissazione più lungo può influire negativamente sull'etichettatura EdU.
Rimuovere la glutaraldeide risciacquando i campioni con PBS integrato con cinque millimoli di cloruro di magnesio, ulteriormente considerato come stella PBS. Lavare tre volte per 10 minuti. Permeabilizzare le membrane plasmatiche con una soluzione all'1% di Trione X-100 nella stella PBS, apportare due modifiche per cinque minuti ciascuna.
Questa soluzione è ulteriormente indicata come stella PBS T.Lavare estensivamente il campione con la stella PBS. Cinque cambi per cinque minuti ciascuno. Spegnere i gruppi di aldeide residua con 20 millimoli di glicina nella stella PBS, due volte per 10 minuti.
Posizionare il campione nella stella PBS con l'1% di BSA per mezz'ora. Durante il blocco in BSA, preparare il cocktail di reazione per il rilevamento edU. L'ordine di aggiunta dei componenti è importante.
La coniugazione edU biotina-azide viene eseguita nella camera umida per ridurre al minimo l'evaporazione e gli spostamenti di concentrazione nel cocktail di reazione. Preparare la camera umida. Posizionare il coverslip sul para-film con una cella rivolta verso l'alto e lo strato da 50 a 100 microlitri del cocktail di reazione sul coverslip.
La reazione richiede 30 minuti a temperatura ambiente. Interrompere la reazione lavando il campione nella stella PBS T, cinque volte per cinque minuti ciascuna. Blocca di nuovo con l'1% BSA nella stella PBS T per un'altra mezz'ora.
Preparare la soluzione di streptavidina-Nanogold in PBS stella T con 1% BSA. Incubare il campione con streptavidina durante la notte a più quattro gradi in una camera umida appena preparata. La procedura è la stessa della coniugazione Biotina-azide EdU.
Interrompere la reazione e lavare il campione, cinque volte per 10 minuti ciascuno con la stella PBS T.Stabilizzare il complesso di streptavidina biotina mediante fissazione aggiuntiva sarà 1% glutaraldeide PBS stella per mezz'ora. Rimuovere la glutaraldeide mediante lavaggio intenso con acqua deionizzata. Spegnere i gruppi di aldeide residua con un milligrammo per millilitro di boroidruro di sodio.
Lavare di nuovo accuratamente. Il prossimo passo è aumentare le dimensioni delle particelle di Nanogold per mezzo della deposizione di argento sul corso d'oro. Preparare le premiscele per ridurre al minimo l'attività della camera oscura.
Equilibrare i campioni con tampone di lavaggio e procedere in una camera oscura. Nella camera oscura mescolare i componenti per preparare la soluzione di lavaggio e applicarla ai campioni. La soluzione di polvere di acacia è altamente visibile.
Quindi, durante la miscelazione dei componenti, scuotere lentamente il tubo per evitare la formazione di bolle e schiuma. La reazione richiede da due a cinque minuti. Si consiglia di eseguire un test per determinare il tempo di reazione ottimale.
Un tempo di incubazione più lungo può comportare una deposizione di argento non specifica. Per fermare la reazione, risciacquare rapidamente il campione con tre o cinque cambi di acqua deionizzata. Seguito da altri tre cambi per cinque minuti ciascuno.
Per proteggere le nanoparticelle d'argento dalla dissoluzione da parte del tetrossido di osmio, incubare i campioni in acido tetracloroaurico allo 0,05% per due minuti al buio. Lavare accuratamente con acqua deionizzata. In questa fase, viene aggiunto un ulteriore contrasto al materiale contenente DNA.
Saturare il campione con la macchia di DNA DRAQ5. Aggiungere la soluzione di diamionobenzidina al campione e incubare per un minuto. Spostare il coperchio nella capsula di Petri con fondo di vetro e posizionarlo sul palco del microscopio invertito.
Irradiare diversi campi visivi con luce rossa a 640 nanometri. Il pannello di sinistra mostra lo sbiancamento fotografico completo di DRAQ5. Sul pannello di destra, lo stesso campo visivo viene ripreso nella luce trasmessa che mostra il precipitato DAB.
Lavare i campioni con acqua deionizzata. La fase successiva dovrebbe essere eseguita sotto il cofano dei fumi. Soluzione di tetrossido di osmio parzialmente ridotta preparata.
Stai attento. Questa sostanza è altamente volatile e tossica. Applicare la soluzione preparata sul campione.
In questa fase, i composti di osmio ridotti reagiscono con le deposizioni di diamionobenzidina e aumentano il contrasto del DNA. Smaltire la soluzione contenente osmio secondo la normativa locale e lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno. Il campione viene ulteriormente disidratato in una serie di concentrazioni crescenti di etanolo seguite dall'infiltrazione delle cellule con miscele di resina etanolo.
Sostituire la miscela di resina alcolica con resina pura appena preparata. Riempire lo stampo di incorporamento di dimensioni adeguate con una resina appena preparata. Posizionare il coperchio con una cella rivolta verso il basso sopra la cavità riempita di resina.
Polimerizzare la resina per 24 ore a 37 gradi. Quindi a 60 gradi per almeno due giorni. Rimuovere la resina da una superficie inferiore di una copertura.
Far cadere la lastra in un azoto liquido e quindi trasferirla in acqua bollente. Il vetro dovrebbe staccarsi. Ripetere l'operazione se necessario.
I campi visivi irradiati dovrebbero essere chiaramente visibili a causa della deposizione di diamionobenzidina e della colorazione DAB. Ritaglia l'area di interesse dalla lastra usando il seghetto o qualsiasi altro strumento adatto. Posizionare il ritaglio nel supporto semplice ultramicrotome.
Impostare l'ultramicrotomo per il taglio del blocco finale. Usando la lama del rasoio, prepara il pillet a forma di piramide. La dimensione di un'area piatta in cima alla piramide dovrebbe essere di circa 400 per 200 micron.
Montare la piramide preparata nel braccio ultramicrotomico e installare il coltello. Preparare le sezioni. Lo spessore della sezione può essere regolato in base alle esigenze sperimentali.
Puntiamo alla tomografia EM. Così abbiamo preparato sezioni con uno spessore di 250 nanometri denominate anche sezioni semisottili. Staccare le sezioni dal bordo del coltello e montarle su una griglia a fessura.
Abbiamo usato una griglia a fessura, erano rotondi di un millimetro per essere intorno, un millimetro di apertura laterale. Le dimensioni ridotte dell'apertura forniscono una migliore stabilità delle sezioni. Lasciare asciugare i campioni sulla griglia.
In questo momento, le sezioni sono pronte per l'osservazione. Posizionare la griglia nel portacampioni del microscopio elettronico. Caricare il campione nel microscopio elettronico.
Acquisire serie di inclinazione. I focolai di replicazione nei nuclei cellulari di mammifero mostrano modelli distinti di distribuzione a seconda della progressione della fase S. Il successo dell'etichettatura EdU confermata dalla reazione del clic con azide marcata fluorescentemente dimostra il tipico modello di replicazione nella popolazione cellulare eterogenea dopo la fissazione della glutaraldeide in cima.
L'etichettatura della streptavidina può essere influenzata dalla glutaraldeide. Quindi prima controlla la colorazione di streptavidina a fluorescenza nelle stesse condizioni della streptavidina nanogold sul fondo. Un buon risultato della procedura di miglioramento dell'argento è una colorazione marrone scuro di alcuni nuclei e una macchia di citoplasto giallo molto svenuta, mostrata sul fondo.
Il vantaggio di un'etichettatura pre-incorporamento è la possibilità di selezionare le celle per il sezionamento. È possibile in questa fase perché i modelli di etichettatura diventano visibili al microscopio a campo luminoso. L'etichettatura appropriata genera siti di replica ben delimitati.
Arrowhead mostra le fibre di cromatina macchiate DAB. L'etichettatura di sfondo sulla destra è limitata a poche nanoparticelle per micron quadrato. Le sezioni semisottili sono pronte per la tomografia e non richiedono l'aggiunta di nanoparticelle d'oro.
L'approccio descritto utilizzato per gli studi sull'organizzazione della cromatina in siti con replicazione abilitata. Per l'analisi del riarrangiamento post replicativo della cromatina, compresa l'imaging ad alta risoluzione della segregazione della cromatina. Utilizzato anche per l'etichettatura replicata di grandi domini cromosomici e studi di ripiegamento della cromatina di ordine superiore e di eterocromatina.
Questa tecnica di imaging è importante anche come punto di riferimento per i dati generati da altri approcci non microscopici. Il metodo può anche essere adattato in studi microscopici correlati, comprese le tecniche di super risoluzione. Questo apre nuovi orizzonti negli studi sulla struttura di ordine superiore della cromatina e sulla sua dinamica nei vari stati fisiologici della cellula.
