Questo protocollo è importante in quanto consente di studiare il sistema glinfatico in un grande mammifero, avvicinandoci così alla comprensione del sistema glinfatico negli esseri umani. Ci sono due vantaggi in questa tecnica. L'introduzione di tracce nella cisterna magna evita qualsiasi danno diretto al cervello, che è in contrasto con le iniezioni intraventricolari.
In secondo luogo, questo è un approccio diretto che consente la visualizzazione immediata della cannulazione e sapere se ha avuto successo o meno. Inizia posizionando il maiale in posizione prona. Palpare la parte posteriore della testa e del collo per individuare e segnare la cresta occipitale, la colonna vertebrale delle prime vertebre toraciche e la base di ciascun orecchio.
Disegna una linea retta tra la cresta e le vertebre lungo l'asse longitudinale. Quindi seguendo la base del cranio, disegna due linee dalla cresta alla base di ciascun orecchio. Blocca con attenzione la coda dell'animale e osserva un riflesso per vedere se è in un sonno profondo.
Inizia facendo un'incisione dermica lungo la linea longitudinale fino al muscolo usando un bisturi con una lama numero 21, quindi estendi due incisioni perpendicolari più avanti lungo le spalle, ciascuna lunga da 10 a 15 centimetri. Partendo dalla cresta occipitale, fare incisioni dermiche lungo la linea fino alla base di ciascun orecchio. Utilizzare una pinza anatomica per afferrare gli angoli della pelle formati sulla cresta occipitale, quindi eseguire leggermente la lama del bisturi sulla fascia per separare la pelle dal muscolo sottostante.
Riseziona la pelle lungo ciascuna delle cinque incisioni per visualizzare parti del muscolo trapezio. Utilizzare il bisturi per fare un'incisione longitudinale profonda circa un centimetro in cui il trapezio si riunisce sulla linea mediana, quindi eseguire una dissezione smussata lungo il taglio longitudinale nei muscoli utilizzando una combinazione di pinze chirurgiche dritte e curve, che separeranno le pance del trapezio e il muscolo semispinalis capitis biventer sottostante. Tagliare tutte le fibre muscolari persistenti con un bisturi e continuare a eseguire una dissezione smussata fino a quando il semispinalis capitis complexus diventa visibile.
Muoviti lungo l'aspetto posteriore del cranio e taglia le origini dei muscoli trapezio e semispinalis capitis biventer. Per separare i due muscoli longitudinalmente, utilizzare la pinza chirurgica per eseguire la dissezione smussata fino a quando il semispinalis capitis complexus è completamente visibile. Quindi utilizzare i divaricatori auto-trattenitori per ritrarre i muscoli trapezio e semispinalis capitis biventer.
Usa il bisturi per fare un'incisione longitudinale profonda un centimetro in cui le pance del semispinalis capitis complexus si uniscono sulla linea mediana. Eseguire una dissezione smussata utilizzando una pinza chirurgica lavorando lungo il taglio longitudinale tra le pance muscolari fino a quando sia l'atlante che l'asse sono palpabili. Muoviti lungo l'aspetto posteriore del cranio, recidendo le origini dei muscoli semispinalis capitis complexus.
Utilizzare il bisturi e la dissezione smussata per separare il muscolo longitudinalmente dalle vertebre sottostanti, quindi utilizzare un altro set di riavvolgitori auto-trattenitori per ritrarre i muscoli semispinalis capitis complexus. Utilizzare un bisturi per rimuovere con cura qualsiasi tessuto rimanente sovrastante la regione in cui l'atlante incontra la base del cranio. Metti un braccio sul collo dell'animale e un dito alla congiunzione dell'atlante e del cranio, quindi solleva contemporaneamente la testa e fletti il collo mentre palpa con il dito per rivelare la cisterna magna.
Assicurarsi che una persona elevi e fletti la testa e il collo dell'animale mentre l'altra palpa per la cisterna magna, prendendo nota della sua posizione anatomica. Introdurre una cannula calibro 22 lentamente e con attenzione nella cisterna magna attraverso la dura con un angolo obliquo rispetto all'asse longitudinale, quindi ritrarre l'ago dalla cannula e posizionare un cappuccio sulla serratura. Inizia con l'applicazione di super colla e un acceleratore in cui la cannula entra nel tessuto, quindi applica il cemento dentale.
Attendere cinque minuti affinché il cemento si indurisca. Rimuovere il cappuccio con attenzione dalla cannula. Attaccare la cannula all'estremità maschile del rubinetto della linea IV con il tracciante utilizzando un'estensione di 10 centimetri.
Iniettare lentamente il tracciante ad una velocità di 100 microlitri al minuto a mano o utilizzando una micropompa per infusione. Rimuovere il rubinetto della linea IV e sostituirlo con il cappuccio. Controllare se il tracciante è visibile pulsante alla base della cannula.
Quindi posizionare sacchi di sabbia sotto il collo dell'animale per mantenere una certa flessione. Rilascia la testa e lascia l'animale in posizione prona a riposo. Rilasciare i riavvolgitori auto-trattenitori e sostituire i muscoli.
Utilizzare i morsetti per asciugamani chirurgici per riunire la pelle sopra i muscoli. Prima usa una garza e poi una coperta per coprire i morsetti degli asciugamani e l'incisione per limitare la perdita di calore. Lasciare circolare il tracciante per il periodo di tempo desiderato.
Le immagini macroscopiche cucite della superficie dorsale del cervello possono fornire informazioni dettagliate sui modelli di distribuzione del tracciante attraverso i solchi e le fessure. Immagini simili dalle superfici ventrali e laterali del cervello possono fornire informazioni sulla distribuzione del tracciante nel lobo temporale e nella fessura laterale. Le immagini della superficie cerebrale di ingrandimento più elevato prodotte utilizzando uno stereoscopio possono aiutare a visualizzare il tracciante nel PVS lungo le arterie.
Le sezioni macroscopiche del cervello coronale forniscono informazioni sulla profondità della penetrazione del tracciante nella fessura interemisferica e nella distribuzione e struttura del tracciante sottocorticale, come l'ippocampo e lo striato. La colorazione immunoistochimica per AQP4, proteina acida fibrillare gliale e actina della muscolatura liscia ha mostrato che il tracciante si è localizzato all'interno del PVS, così come si è spostato nel parenchima cerebrale. I processi del piede astrocitario che formano la superficie esterna del PVS sono identificati utilizzando AQP4 e la colorazione delle proteine acide fibrillari gliali.
Le cellule endoteliali che formano la superficie interna del PVS vengono colorate usando lectina e glut-1. La colorazione SMA identifica le arterie e le arteriole e può essere utilizzata per dimostrare che l'afflusso di PVS si verifica lungo le arterie anziché le vene, che costituisce la fisiologia di base della normale funzione glinfatica. Andando avanti, speriamo di esplorare il sistema glinfatico ad alta risoluzione nei grandi mammiferi nel contesto della neuropatologia come l'ictus e le lesioni cerebrali traumatiche.
