Questo protocollo aiuta a isolare gli endosomi di riciclaggio contenenti frazione da cellule di mammifero trasfettate per facilitare lo studio del traffico proteico attraverso il traffico endocitico. Questa tecnica è facile da maneggiare e applicabile sia ai campioni di tessuto che a quelli cellulari. A dimostrare la procedura sarà miss Zhai Yu Qi, dottoranda del Dr.Lao's Laboratory.
Per iniziare, piastra 2 volte 10 alle 6 celle in un piatto di coltura da 100 millimetri. Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore. Per raccogliere le cellule, scartare il terreno di coltura 48 ore dopo la trasfezione e lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato.
Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato integrato con cocktail inibitore della proteasi 0,5X in cocktail inibitore della fosfatasi 0,5X a ciascun piatto. Successivamente, utilizzando un raschietto cellulare, raccogliere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. le celle mediante centrifugazione mediante rotore a benna oscillante.
Scartare il surnatante e risospescere delicatamente il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di omogeneizzazione. Raccogliere nuovamente le cellule mediante centrifugazione e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di omogeneizzazione. Omogeneizzare le cellule con un omogeneizzatore Dounce usando da 15 a 20 colpi.
Quindi trasferire l'omogonato in un tubo di centrifugazione da due millilitri. Aggiungere 700 microlitri di buffer di omogeneizzazione all'omogonato. Quindi ruotare l'omogonato diluito e raccogliere 1,5 millilitri del surnatante.
Ruotare di nuovo il surnatante raccolto, quindi raccogliere 1,4 millilitri del surnatante ed etichettarlo come surnatante post-nucleare. Per preparare la colonna del gradiente di densità, trasferire 1,2 millilitri del surnatante post-nucleare in un tubo ultracentrifuga. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di saccarosio al 62% al campione e mescolare bene con un pipettaggio delicato.
Quindi, aggiungere con attenzione 3,3 millilitri di soluzione di saccarosio al 35% sopra il campione, seguito da 2,2 millilitri di soluzione di saccarosio al 25% sopra la soluzione di saccarosio al 35%. Infine, riempire il tubo ultracentrifuga verso l'alto con un tampone di omogeneizzazione. Centrifugare la colonna del gradiente di densità e raccogliere con cura 12 frazioni di 1 millilitro ciascuna, partendo dalla parte superiore del gradiente.
Quindi, diluire tutte le frazioni con un millilitro di tampone di diluizione e centrifugare i campioni diluiti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 50 microlitri di tampone campione 1X per raccogliere le frazioni. Il marcatore endosomico di riciclaggio Rab11 è stato rilevato nella frazione sette.
Sono stati sondati anche altri marcatori subcellulari, tra cui beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 e Lamp1. Un segnale EEA1 positivo è stato rilevato anche nella frazione sette. Le intensità di banda misurate di GAPDH, Cox IV e Rab11 sia nella frazione sette che nel surnatante post-nucleare sono mostrate qui.
Dopo aver transettato le cellule HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, non sono stati riscontrati cambiamenti nella distribuzione ELMO1 con sovraespressione di ARF6Q67L e FE65. Il livello di ELMO1 nella Frazione sette è stato confrontato tra diverse trasfezioni ed è risultato elevato dopo la cotrasfezione di ARF6Q67L. Un ulteriore aumento è stato osservato quando sia ARF6Q67L che FE65 sono stati co-espressi.
Al contrario, l'eliminazione di FE65 ha diminuito l'arricchimento Elmo1 mediato da ARF6 nella frazione sette. La frazione ottenuta potrebbe essere utilizzata per analisi successive. Ad esempio, western blotting per visualizzare i cambiamenti del livello proteico nella frazione.
