Il protocollo presentato viene utilizzato per lo screening ad alto rendimento e l'identificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira trasportatori elettrogenici ricostituiti nei proteoliposomi o presenti nelle vescicole di membrana. La progettazione di saggi di trasferimento può essere difficile in più casi, specialmente se non sono disponibili substrati etichettati. Se la stessa elettrofisiologia consente di studiare l'effetto dei nanocorpi sul trasporto praticamente per qualsiasi trasportatore elettrogenico, poiché l'elettrofisiologia SSM non richiede substrati etichettati.
I nanocorpi sono stati studiati per il loro utilizzo in applicazioni mediche. Questa tecnica può aiutare a selezionare potenziali inibitori che prendono di mira specifici trasportatori elettrogenici di esseri umani o agenti patogeni umani. Per iniziare, prendi 10 tubi puliti e trasferisci 10 millilitri del buffer a supporto solido non attivante, o SSM, in ciascun tubo.
Per preparare i tamponi SSM attivanti, aggiungere il substrato nei tubi utilizzando una serie di concentrazioni intorno alla metà della concentrazione massima prevista. Avviare il software SSM e consentire all'inizializzazione automatica della macchina. Impostare il percorso di salvataggio per i dati.
Confermare premendo il pulsante OK. Selezionare il protocollo di pulizia iniziale standard nelle opzioni del flusso di lavoro e fare clic su Esegui. Quindi, montare il chip rivestito di proteoliposoma sulla presa.
Spostare il braccio per bloccare il chip. Racchiudere il chip montato con il cappuccio. Selezionare il programma CapCom nel flusso di lavoro e lasciarlo funzionare per determinare la conduttività e la capacità.
Confermare che la conduttività è inferiore a cinque nanosiemens e la capacità è compresa tra 15 e 35 nanofarad prima di utilizzarla per la misurazione. Trasferire le soluzioni attivanti in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore di sonda. Trasferire il buffer non attivante in un serbatoio e posizionarlo accanto al portachip nella posizione del serbatoio sulla destra.
Creare un protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza di sequenza di soluzione non attivante, attivante e non attivante oppure una sequenza BAB in un ciclo che esegue tre misurazioni e passa al buffer di attivazione successivo per tutti e 10 i buffer. Utilizzare la portata predefinita di 200 microlitri al secondo con tempi di flusso di un secondo, un secondo, un secondo per la sequenza BAB e fare clic su Riproduci per avviare la misurazione. Salvare il protocollo e lasciare che il flusso di lavoro venga eseguito facendo clic sul pulsante di riproduzione.
Quindi eseguire lo stesso esperimento utilizzando liposomi privi di proteine. Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo e utilizzare la funzione per la stima dell'altezza del picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione. Tracciare la corrente di picco rispetto alla concentrazione del substrato per determinare l'effetto semi-massimale della concentrazione, o EC50, del substrato tramite regressione non lineare.
Trasferire 50 millilitri del buffer SSM non attivante in un tubo pulito. Aggiungere la colina del substrato a una concentrazione finale di cinque millimolari e utilizzarla per una misurazione di controllo positivo. Trasferire 10 millilitri del buffer SSM non attivante in un tubo pulito.
Aggiungere colina substrato a cinque millimolari e nanocorpi a 500 nanomolari concentrazione finale. Ripetere il passaggio per ogni nanocorpo per preparare le soluzioni attivanti come dimostrato. Avviare la macchina SSM e misurare la capacità e la conduttività del chip rivestito di proteoliposoma, come dimostrato in precedenza.
Trasferire la soluzione attivante senza nanocorpo in un flaconcino e posizionare il tampone nel campionatore della sonda. Trasferire il buffer non attivante senza nanocorpo in un serbatoio e posizionarlo nel campionatore della sonda. Quindi ripetere questo processo per tutte le soluzioni contenenti nanocorpi con soluzione attivante e non attivante.
Creare un protocollo per il flusso di lavoro Utilizzando una sequenza BAB. Creare un loop che esegua tre misurazioni della sequenza BAB utilizzando buffer senza nanocorpi, due misurazioni della sequenza BAB con buffer contenenti un nanocorpo, 120 secondi di ritardo di incubazione con il nanocorpo e tre misurazioni della sequenza BAB con buffer contenenti il nanocorpo. Salvare il flusso di lavoro e lasciarlo funzionare facendo clic sul pulsante di riproduzione.
Successivamente, creare un nuovo protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza BAB e un ciclo di cinque misurazioni per eliminare il nano corpo legato in modo reversibile. Salvare il flusso di lavoro e lasciarlo funzionare facendo clic sul pulsante di riproduzione. Confrontare l'ultima corrente di picco delle misurazioni con la misurazione iniziale del solo substrato.
Se la corrente di picco raggiunge il valore iniziale, il nanocorpo è stato lavato con successo e le condizioni iniziali sono state ristabilite. In caso contrario, ripetere il flusso di lavoro o passare a un nuovo chip. Ripeti questo processo usando singoli chip per ogni schermo nanobody o ripeti con più nanocorpi usando lo stesso chip.
Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo. Quindi il software seleziona automaticamente la funzione per la stima dell'altezza del picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione. Normalizzare la corrente di picco e la presenza del nanocorpo in base alla misurazione del solo substrato in corso.
Tracciare le correnti di picco nell'istogramma e confrontare le correnti di picco delle misurazioni solo substrato con le correnti di picco misurate in presenza di nanocorpi per identificare nanocorpi inibitori. Trasferire 50 millilitri del tampone SSM non attivante in un tubo pulito e aggiungere la colina del substrato a una concentrazione finale di cinque millimolari e utilizzarla come soluzione attivante per il controllo positivo. Aggiungere cinque millilitri della soluzione non attivante a otto tubi puliti, quindi aggiungere colina substrato e nanocorpo inibitorio ai tubi a concentrazioni nell'intervallo IC50 previsto.
Aggiungere 10 millilitri della soluzione non attivante agli otto tubi e aggiungere nanocorpi inibitori a ciascun tubo corrispondente al tampone di non attivazione. Avviare la configurazione SSM e misurare la capacità e la conduttività del chip rivestito di proteoliposoma. Trasferire la soluzione attivante senza nanocorpo in un flaconcino e posizionarla nel campionatore della sonda.
Quindi trasferire il buffer non attivante senza nanocorpo in un serbatoio e posizionarlo nella posizione del serbatoio accanto al supporto del chip a destra. Trasferire le soluzioni attivanti e non attivanti contenenti nanocorpi in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore della sonda. Creare un protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza BAB.
Includi un ciclo per misurare ogni concentrazione due volte, incuba per 120 secondi e misura altre tre volte. Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo e selezionare la funzione per la stima dell'altezza di picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione. Traccia le correnti di picco rispetto alla concentrazione di nanocorpi per determinare l'IC50 tramite regressione non lineare.
Per determinare la concentrazione del substrato da utilizzare durante uno screening dei nanocorpi, il trasporto elettrogenico è stato misurato in diverse concentrazioni di substrato per determinare EC50. Una concentrazione di substrato corrispondente alle condizioni di saturazione, cinque millimolari, è stata selezionata e mantenuta costante in tutti i tamponi attivanti. L'effetto dei nanocorpi inibitori sul trasporto elettrogenico è stato visualizzato dalla diminuzione delle ampiezze delle correnti di picco.
Dopo aver eseguito il protocollo di lavaggio per consentire lo svincolo dei nanocorpi, è stato osservato un recupero dell'80-95% dell'ampiezza iniziale della corrente di picco. Quando si passa da condizioni non attivanti a condizioni attivanti, non sono state introdotte correnti artefatte significative dai nanocorpi presenti in questi buffer. Dopo aver selezionato nanocorpi con proprietà inibitorie, sono stati determinati i valori IC50 per i singoli nanocorpi.
È fondamentale dare abbastanza tempo per la calibrazione dei proteolipolisi sul chip con il buffer contenente il nanocorpo. Poiché il legame è reversibile, il nanocorpo deve essere presente sia nei buffer attivanti che in quelli non attivanti.
