L'obiettivo generale di questo protocollo è lo screening di espressione di costrutto multiplo di proteina arginina metiltransferasi in produzione su larga scala per ottenere la quantità milligrammo della proteina per studi biochimici, biofisici e strutturali nel mezzo supportato, modalità economica nella copertura della piattaforma di espressione S, sistema vettoriale di espressione baculovirus. La Dott.ssa Alma Seitova presenterà i seguenti passaggi. Diluire le cellule SF9 in crescita esponenziale alla densità cellulare finale di 0,4 milioni per milione nel mezzo di insetti privo di siero e versare nel serbatoio del reagente sterile.
Utilizzare una pipetta multicanale programmabile per seminare 0,5 mils delle celle SF9 diluite in ogni pozzo della piastra a 24 potte. Questo volume è sufficiente per garantire una copertura uniforme della superficie di lavoro del pozzo. Allo stesso tempo, non diluizza troppo il mix di trasfezione, il che consente l'efficienza di trasfezione.
Etichettare un pozzo della piastra solo come cella e utilizzarlo come controllo per il confronto della cellula trasfettata e non trasfettata per valutare i potenziali segni di infezione. Incubare le piastre a 27 gradi fino a quando necessario, circa un'ora, per lasciare che le cellule si attaccano alle piastre di coltura cellulare. Diluire il reagente di trasfezione ben miscelato nel mezzo insetto non soffantato e in un serbatoio di reagente sterile e mescolare delicatamente per 10 secondi.
Utilizzando una pipetta a 12 canali, trasferire 102 microlitri del reagente di transazione diluito in una piastra sterile da 96 MicroWell. Trasferire 10 microlitri da 0,2 microgrammi per microlitro di DNA bacmide ricombinante nel pozzo corrispondente della piastra MicroWell da 96 pozzi e mescolare scuotendo delicatamente, toccando la piastra dai lati. Incubare la miscela di trasfezione per 15-20 minuti per una formazione complessa.
Utilizzando una pipetta regolabile a sei canali progettata per il trasferimento tra una piastra da 96 e 24 poggia, sovrapporre la miscela di trasfezione alle celle per quanto riguarda la caduta nei pozzi corrispondenti delle piastre di trasfezione e incubare per quattro ore a 27 gradi. Per garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione sul monostrato delle cellule, scuotere delicatamente le piastre avanti e indietro più volte durante il tempo di incubazione. Da quattro a cinque ore dopo il tempo di trasfezione, aggiungi 1,5 milioni di supporti per insetti senza siero.
Completarlo con il 10% finale di siero bovino fetale inattivato dal calore e l'1% antibiotico e antimicotico. Incubare le cellule in un incubatore di 27 gradi per 72-96 ore. Scuotere delicatamente le piastre di trasfezione una volta al giorno quando possibile.
Cercare i segni di infezione evidenti nelle cellule trasfette a 72-96 ore dopo il tempo di trasfezione. Da quattro a cinque giorni dopo la trasfezione, i segni di infezione dovrebbero essere evidenti nelle cellule trasfette rispetto alle cellule di controllo al microscopio invertito e i baculovirus ricombinanti iniziali secreti nel mezzo di coltura cellulare dovrebbero essere pronti per essere raccolti. Utilizzare un multicanale elettronico programmabile per consentire contemporaneamente la raccolta di virus P1, l'infezione di cellule SF9 appena sementi nell'infezione delle cellule sospese nei loro 24 blocchi di pozzo con 150 microlitri dei virus P1.
Spin down il resto delle scorte virali collettive P1 per 15 minuti, coprire i 24 blocchi di pozzo con coltura di sospensione delle cellule SF9 infette con un foglio AirPore. Incubare il blocco di 24 pozzi a 27 gradi con tremori a 245 RPM per 72-96 ore. Quattro giorni prima del tempo di produzione programmato, dividere le cellule SF9 in crescita esponenziale, a una densità cellulare finale di 2 milioni per milione in filo interdentale di frullato di vetro Erlenmeyer con deflettori in mezzi di insetti senza siero contenenti 1% di antibiotico finale e antimicotico.
Questo passaggio genererà una coltura di sospensione di cellule di insetti infette e virus P2 nel supernatante per l'infezione di nuove cellule nel lotto di produzione. Aggiungere i corrispondenti virus P2 e incubare le cellule infette alla temperatura inferiore di 25 gradi per rallentare la crescita cellulare, tremando a 165 RPM su uno shaker orbitale con un colpo di un pollice. Quattro giorni prima del tempo di produzione programmato, semina due litri di cellule SF9 in crescita esponenziale in mezzi senza siero di insetti alla densità cellulare di 1 milione per mil, nel pallone shake Fernbach da 2,8 litri.
Scuotere il pallone a 27 gradi con trema a 150 RPM. La ricercatrice Ashley Hutchinson dimostrerà il seguente protocollo. Dividi quattro litri di cellule SF9 in crescita esponenziale e mezzi senza siero di insetti fino alla densità cellulare finale di 4 milioni per milione nelle grandi bottiglie di reagente da cinque litri.
Aggiungere da 10 a 12 mils della coltura di sospensione delle cellule di insetti infettate da baculovirus. Incubare la coltura infetta delle cellule SF9 in uno shaker che scuote 145 giri/min a una temperatura inferiore di 25 gradi Celsius per 72-96 ore. Quantità milligrammi di diverse proteine ricombinanti della famiglia PRMT esprimono nel baculovirus la produzione immediata nelle cellule SF9 sono utilizzate per studi clinici biochimici biofisici, come si può vedere nella figura cinque.
All'SGC, le strutture cristalline sono state risolte depositate nella banca dati proteica per l'intera lunghezza o le forme troncate delle proteine PRMT4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati per aggiungere la raccolta genica da SGC e sono disponibili per la comunità di ricerca. In questo video, abbiamo sottolineato gli elementi chiave per lo screening di spedizione di successo del loro costrutto multiplo della proteina arginina metiltransferasi nella produzione su larga scala nel sistema di espressione del baculovirus.
L'uso delle normali pipette multicanale regolabili e programmabili, ha reso il loro intero processo più rapido che efficiente. L'uso di sostanze tossiche per le cellule ad alte prestazioni e meno cellulari, il reagente di trasfezione per la generazione di virus ricombinanti ha portato a un rapporto costi-efficaci e a questo protocollo di trasfezione per la gestione cellulare. L'infezione del lotto su larga scala per la produzione di proteine con coltura di sospensione del baculovirus infettato in sei cellule ha ridotto significativamente le fatiche in un passo dispendioso in termini di tempo nell'amplificazione vitale dell'avviamento.
È ad esempio, centrifugando questo con una coltura speciale di cellule infette. Questo è ovviamente escluso la gestione extra delle cellule infette in evitare nel loro più stretto nella degradazione del virus. La manutenzione delle celle di coltura delle sospensioni in questa produzione di scale up nel contenitore di coltura è stata un volume di campo elevato che ci ha aiutato a superare la limitazione del volume di produzione e ad adottare una piattaforma su larga scala.
Questo è molto utile per i laboratori senza accesso ai bioreattori o spazio limitato nella pipeline di produzione. Sebbene il nostro protocollo sia stato descritto per le proteine della famiglia delle proteine arginina metiltransferasi, lo stesso approccio può essere applicato a qualsiasi altra famiglia di proteine che richiede una piattaforma di espressione per ottenere una quantità sufficiente della loro proteina per studi didattici biochimici biofisici.
