L'isolamento o l'arricchimento di piccole regioni disperse di interesse da FFPE, o materiale fresco congelato, può essere ottenuto con la dissezione automatizzata in modo più rapido ed efficiente rispetto ai metodi tradizionali. L'estrazione di materiale genomico da FFPE, o tessuto fresco congelato, è un requisito per molti laboratori di ricerca clinica e traslazionale. La dissezione automatizzata colma un divario significativo tra la macro dissezione e la micro dissezione a cattura laser.
Per iniziare, annotare le immagini delle diapositive scansionate per le regioni tumorali di interesse, utilizzando una piattaforma di visualizzazione fornita dal fornitore o un visualizzatore open source. Posizionare il vetrino di tessuto campione non macchiato sul palco nella posizione dalla prima alla quarta diapositiva quando si utilizza un riferimento di diapositiva digitale. Creare un processo di fresatura utilizzando il software di dissezione automatica del tessuto aprendo l'elenco Dei processi, quindi selezionare Crea nuovo lavoro e immettere l'ID caso e il nome per immettere il nome del lavoro.
Passare a Spessore e selezionare lo spessore della sezione utilizzando la scheda freccia su o giù. Quindi, vai a Preparazione dei tessuti e seleziona Paraffinato o Deparaffinato. Selezionare Immagine di riferimento"Da file e Importa immagine.
Quindi, selezionare il file da importare dal menu a discesa come riferimento digitale. Scansiona lo stage selezionando il pulsante Scan stage"nell'angolo in basso a destra per catturare ogni diapositiva di tessuto campione dalla prima alla quarta posizione. Per il riferimento sullo stage, trascinate la casella per creare un'area rettangolare sopra il tessuto e selezionate la bolla circolare sotto l'area rettangolare per acquisire l'immagine di riferimento dello stage.
Copiate questo campo rettangolare sulle diapositive di tessuto campione rimanenti nella seconda e quarta posizione della diapositiva selezionando l'opzione di copia nell'angolo superiore destro dell'immagine di riferimento. Quindi, allineare e ridimensionare se necessario. Per l'immagine di riferimento digitale, sovrapporre l'immagine sull'area rettangolare selezionata.
Quindi, ridimensionare e allineare grossolanamente il riferimento digitale, in corso, zoomare, per abbinare al meglio le dimensioni e la posizione sul tessuto campione. Copiate questo campo rettangolare sulle diapositive di tessuto campione rimanenti nella seconda e quarta posizione della diapositiva selezionando l'opzione di copia nell'angolo superiore destro dell'immagine di riferimento. Quindi, allineare e ridimensionare se necessario.
Selezionare il pulsante "Fase di scansione" nell'angolo in basso a destra per passare alla fase di regolazione fine. Selezionate la posizione del primo stadio e l'icona dello strumento Trasforma nella barra degli strumenti di destra per regolare l'allineamento e lo zoom del riferimento in modo che corrispondano al meglio alla sovrapposizione della diapositiva di esempio. Utilizzare il riferimento alla barra di scorrimento del campione nella parte inferiore dello schermo, passando tra le immagini di riferimento e quelle di esempio.
E la funzione di zoom in e zoom out per regolare e ottenere l'allineamento di ogni posizione della diapositiva. Una volta ottenuta la sovrapposizione ottimale del campione, disegnate le designazioni del tracciato di fresatura sulla parte colorata dell'immagine di riferimento mascherata selezionando l'icona dello strumento di selezione colore nella barra degli strumenti di destra. Disegnare i tracciati di fresatura sulle diapositive di esempio selezionando il pulsante Ottieni annotazioni nell'angolo inferiore destro dello schermo.
Acquisire e raccogliere l'area di interesse annotata con quattro o meno punte di fresatura quando viene calcolato il percorso di fresatura. L'utilizzo della punta di fresatura nell'angolo in alto a sinistra viene calcolato in base all'area coperta e alla dimensione della punta selezionata. La dimensione della punta può essere modificata sotto la freccia della punta di fresatura e l'utilizzo della punta verrà ricalcolato.
Quando il tracciato di fresatura viene selezionato nella prima posizione della diapositiva, viene copiato nelle posizioni di scorrimento rimanenti. Selezionare il pulsante "Fase di configurazione" nell'angolo in basso a destra dello schermo per il caricamento rapido delle punte di fresatura dai tubi di raccolta nella loro corretta designazione sul palco. Riempire il serbatoio con tre millilitri di tampone di dissezione appropriato per il tipo di tessuto e per l'estrazione di acidi nucleici a valle.
Quindi, seleziona il pulsante Dissect"nell'angolo in basso a destra dello schermo. Dopo la dissezione automatica, rimuovere dal palco i tubi di raccolta e i vetrini del campione sezionati. Posizionare i tubi di raccolta nel rack del tubo e le diapositive nel rack della slitta.
La formalina colorata H & E, la paraffina fissa incorporata e le sezioni di fegato di topo congelato fresco contenenti carcinoma colorettale metastatico negli xenotrapianti sono state scansionate su un intero imager di diapositive con ingrandimento 20x e utilizzate come diapositive di riferimento. I vetrini di riferimento colorati H & E sono stati annotati e mascherati digitalmente per le regioni tumorali per la dissezione e l'estrazione di acidi nucleici. I vetrini del campione post-sezionati sono stati colorati H & E per confermare le aree di dissezione in vetrini da 10 micrometri e 20 micrometri.
Le metriche acquisite hanno dimostrato il successo della dissezione automatizzata e dell'estrazione di acidi nucleici. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che ottenere una sovrapposizione relativamente accurata di annotazioni sulle diapositive non macchiate è importante per isolare le aree di interesse.
