We thank the Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Br&#252;ckner and Istvan Ando for fly stocks, and antibodies. We thank Marek Jindra and Colin Donohoe for comments on the manuscript. This work was supported by the Sofja Kovalevskaja Award to M.U. from the Alexander von Humboldt Foundation and DFG project UH243/1-1 to M.U. from the German Research Foundation.

NOTA: Questo lavoro utilizza la eyFLP1; atto&gt; y +&gt; GAL4, UAS-GFP; FRT82B, vasca-Gal80 MARCM 82B verde tester linea 11. Attraversando il tester vergini MARCM 82B verdi per i maschi di ceppi, come w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotipo produrrà progenie in cui si verifica la ricombinazione mitotica tra il diritto bracci del 3 ° cromosomi omologhi. In questo modo, i cloni mutanti omozigoti per il gene c trova distale al sito FRT82B sarà generato all&#39;interno della EAD e neuroepitelio cervello. Questi cloni esprimeranno GFP, transgene una e dsRNA per il gene B (Figura 1A). Diverse linee tester eyFLP-marcm per ricombinazione sulla X, 2L, 2R, 3L e 3R sono stati istituiti e sono disponibili all&#39;interno della comunità mosca. 1. Manipolazione Fly, Croci, e messa in scena <ol><li> Espandere il MARCM tester magazzino appropriato a temperatura ambiente popolando bo multiplattles allo stesso tempo. Capovolgere le adulti in bottiglie fresche ogni 2-3 giorni in modo che un numero sufficiente vergini possono essere raccolti per incroci successivi. NOTA: Quando si raccolgono le vergini, evitare l&#39;esposizione prolungata a CO 2 in quanto questo compromette la fecondità femminile. </li><li> A seconda della scala dell&#39;esperimento, istituito croci mosca in fiale che utilizzano almeno 10 vergini tester marcm e 4 maschi (ad esempio, per l&#39;imaging di giornalisti fluorescenti e di immunoistochimica) o in bottiglie con almeno 30 vergini e 10 maschi (ad esempio, per l&#39;isolamento di RNA e la quantificazione di invasività). </li><li> Sollevare progenie a 25 ° C sotto una lunga giornata / 8 ore ciclo luce-buio 16 ore. Capovolgere i genitori in nuovi flaconi / bottiglie ogni 24 ore per facilitare la messa in scena riproducibile di larve e per evitare il sovraffollamento. NOTA: A partire dal giorno 6 dopo uovo posa (AEL), alla fine del terzo controllo instar alimentazione arresto larve, inizia a vagare e immettere pupariation. Al contrario, l&#39;inizio della transizione larvale-pupa può essere delayed o inesistente nelle larve con EAD cuscinetto tumori clonali iperplastici o maligni. </li></ol> 2. Raccolta terza larve instar <ol><li> Per immunostaining, raccogliere circa 20 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare pinze per raccogliere delicatamente le larve dal flacone o bottiglia e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS (PBS). <ol><li> Per l&#39;isolamento di RNA e la quantificazione di invasività, raccogliere almeno 80 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare uno spruzzatore a schizzare PBS in una bottiglia contenente larve mosca fino a coprire la superficie. </li><li> Ammorbidire gli strati superiori di cibo con una spatola e versare il mash cibo contenente le larve in una capsula di Petri. Utilizzando pinze, prendere delicatamente larve e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS. </li></ol></li><li> Lavare le larve con PBS untIl tutto il cibo residuo viene rimosso. Ispezionare le larve con lo stereomicroscopio a fluorescenza con 8 a 16X di ingrandimento per scartare tutti &quot;leopardo larve&quot; che portano punti GFP-positive casuali in tutto il corpo larvale (Figura 2A, 2B e vedere Discussione Girone). NOTA: Per l&#39;isolamento di RNA includere una fase di lavaggio penultima nel 70% EtOH per 1 min. </li><li> Porre la capsula contenente larve selezionato in PBS in ghiaccio fino dissezione. Processo larve entro 30 minuti per evitare effetti negativi di freddo e di fame. </li></ol> 3. dissezione delle larve <ol><li> Per sezionare il EAD sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze per premere delicatamente la parte centrale della larva contro il fondo piatto di vetro. Con la seconda pinza, afferrare i ganci bocca larvali e tirare via dal corpo (Figura 2C). NOTA: La forza di trazione è spesso sufficiente a rompere gli steli ottica che collega l&#39;EAD pair ai lobi cerebrali. Se il cervello o le sue parti restano attaccati alla EAD e la loro presenza non è desiderata per ulteriori applicazioni, tagliare i gambi ottica con l&#39;aiuto di due coppie di pinze. Per i tumori invasivi (ad esempio, ras V12 Scrib 1) la connessione tra EAD e i lobi del cervello diventa sempre più oscurate con il tempo da overgrowing e la migrazione di cellule clonali. <ol><li> Per preparare il complesso EAD / cervello con un intatto cordone nervoso ventrale (VNC) (Figura 2D), utilizzare pinze per tagliare una larva al centro del corpo. Eliminare la metà posteriore. </li><li> Tenere la metà anteriore del corpo larvale tra le punte di una pinza, capovolgere la larva dentro-fuori spingendo i ganci bocca con la punta della seconda pinza e facendo rotolare la cuticola sopra con la prima coppia pinze. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze rimuovere con cura tutti i tessuti estranei (ad esempio, le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino), lasciando la coppia EAD oil complesso EAD / cervello collegato ai ganci bocca. Districare i ganci bocca dalla cuticola sovrastante. Liberare il VNC tagliando le proiezioni assoni che si estendono ai muscoli del corpo e dell&#39;epidermide (figure 1B, 2C, 2D). NOTA: I ganci bocca consentono la manipolazione sicura del tessuto con una pinza e facilitano affondamento più efficiente e facile riconoscimento del tessuto durante il lavaggio. Sezionato EAD cambiamento morfologia relativamente veloce, conservato non fissato in PBS. Limitare il tempo di dissezione per 20-30 min. </li><li> Per trasferire il tessuto, cappotto un P20 micropipetta punta pipettando corpo restante carcasse più volte su e giù. Per trasferire i complessi EAD / cervello più grande, tagliare la punta micropipetta P20 con le forbici. NOTA: La procedura di rivestimento è fondamentale per evitare che si attacchi e la perdita di tessuto sezionato durante il trasferimento. L&#39;uso di una micropipetta P20 minimizza il trasferimento di PBS in soluzione fissativa, diluizione limite indesiderato. <ol><li> Per immunostaining, trasferirela sezionato EAD in una provetta da 0,5 ml riempito con 400 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Utilizzare 1,5 ml di tubo con 1 ml di PFA per EAD grandi / complessi cerebrali pensati per il punteggio di invasività. ATTENZIONE: PFA è altamente tossico. Indossare guanti e indumenti protettivi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. </li><li> Per l&#39;isolamento di RNA trasferire l&#39;EAD sezionato in un nuovo piatto di vetro riempita con PBS freddo. Utilizzare pinze per pulire EAD dalle ghiandole linfatiche ad anello e, per ridurre al minimo le contaminazioni del campione. </li><li> Staccare la EAD dai ganci bocca tagliando il collegamento tra i dischi antenna e bocca ganci con pinze (Figura 2E). Per evitare la degradazione dell&#39;RNA e manufatti di espressione genica, limitare il tempo dissezione a 30 min. Passare al punto 7. NOTA: Un ricercatore esperto può sezionare circa 60 larve in 30 min escluso il tempo necessario per la raccolta delle larve e lavaggio. Totale rendimenti RNA dipendono dalle dimensioni EAD che variano tra i genotipi e Sviluppo deiL fasi. La dissezione di 80-100 coppie controllo EAD dalla fine del III larve instar dovrebbe produrre 5-8 mg di RNA totale. </li></ol></li></ol> 4. Fissaggio, Immunocolorazione, e di montaggio <ol><li> Fix campioni in PFA fissativo per 25 min mentre oscillante a temperatura ambiente. Il tempo di fissaggio può essere estesa fino a 60 min senza alterare la morfologia dei tessuti e la antigenicità delle proteine. </li><li> Rimuovere i campioni fissativo e lavare con PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) tre volte per 10 minuti utilizzando un nutator. Utilizzare un volume sufficiente di PBST per ogni fase di lavaggio (400 ml tubo / 0,5 ml). NOTA: fisso EAD complessi / cervello pensati per il punteggio di invasività non richiedono immunocolorazione. segnale GFP rimane ben visibile dopo la fissazione. Passare al punto 4.4 per la dissezione finale. <ol><li> Per immunostaining, blocco tessuto in 200 ml di una soluzione bloccante (PBST con 0,3% BSA) per 20 minuti con agitazione a temperatura ambiente. <ol><li> Incubare con primanticorpi ary diluiti in 100 ml di una soluzione di saturazione notte a 4 ° C mentre delicatamente agitando. Fare riferimento alla scheda tecnica primaria anticorpo o letteratura pubblicata per la diluizione degli anticorpi consigliata. NOTA: potrebbe aver bisogno di essere ottimizzato La diluizione anticorpo primario. </li><li> Dopo cinque 10 min lavaggi in PBST, tessuti macchia con gli anticorpi secondari fluorescenti diluito in soluzione bloccante mentre delicatamente agitazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare i campioni per tre volte 10 min in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Sostituire PBST con 500 ml di soluzione DAPI-colorazione. Per etichettare F-actina, aggiungere falloidina coniugato ad un colorante fluorescente per soluzione DAPI-colorazione. Dopo 15 min nutazione al buio, lavare tessuti volta per 10 min con PBST. NOTA: etichettatura F-actina può essere effettuata indipendentemente dalla colorazione DAPI. </li><li> Per la fase di dissezione finale, il trasferimento del tessuto di nuovo in un piatto di vetro PBS-riempita con un pi 1 mlPette. Utilizzando le due coppie di pinze clip fuori i ganci bocca. <ol><li> Separare i cervelli che verranno utilizzati per la quantificazione della invasività dal EAD tagliando il gambo ottica come EAD invaso potrebbe ostacolare l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Mettere una goccia di mezzo di montaggio (15 microlitri per da 22 copri oggetto x 22 mm) su un vetrino oggettivo. Con l&#39;aiuto di pinze punte, distribuire il medium in uno strato sottile. Trasferimento EAD, cervello o complessi EAD / cervello nel mezzo di montaggio con una micropipetta P20. </li><li> Utilizzare i suggerimenti forcipe o una bacchetta di tungsteno per la distribuzione dei tessuti e raddrizzare il VNC sulla diapositiva. </li><li> Per evitare la formazione di bolle durante il montaggio, prima verso un bordo di un vetrino al mezzo di montaggio e poi lentamente inferiore sul montante con l&#39;aiuto di pinze. Usare piccoli pezzi di carta da filtro o tessuto wipe per assorbire mezzo di montaggio in eccesso intorno ai bordi coprioggetto. NOTA: DABCO / Poli (vinil alcool) 4-88 montaggio indurisce mediea 4 ° C in un&#39;ora. Le diapositive possono essere conservati per mesi a 4 ° C. </li></ol> 5. confocale Imaging <ol><li> Acquisire sezioni confocale singoli e pile utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con 20X, 40X obiettivi del petrolio e 60X. </li><li> Evitare la saturazione dei pixel. Utilizzare stessi parametri di acquisizione delle immagini, tra cui la risoluzione dell&#39;immagine, potenza in ingresso del laser, il guadagno, offset, cornice media, una dimensione di passo di una serie Z e mantenere queste impostazioni per tutti i genotipi per consentire il confronto di intensità dei pixel tra i diversi genotipi 21,22. NOTA: Per la visualizzazione del complesso / cervello EAD, generare il massimo proiezioni e cucire rispettivi, immagini vicine. Per la preparazione immagine finale, utilizzare posta software di elaborazione delle immagini per il montaggio del pannello e per regolare la luminosità e il contrasto. </li></ol> 6. Quantificazione del tumore invasività <ol><li> Definire un sistema di punteggio che caratterizzano i diversi livelli di invasivenes tumoralis considerando il modello spaziale di invasione e la quantità di cellule GFP-positive diffusione nel cervello e VNC. Preparare schede di valutazione per la documentazione (Figura 3A). </li><li> Mount almeno 80 fissato cervelli intatti per ogni genotipo su una diapositiva con 40 ml di mezzo di montaggio per 24 millimetri x 50 mm coprioggetto. <ol><li> Per consentire di punteggio imparziale, chiedere una parte neutrale a rendere anonima le diapositive, in modo che la procedura di punteggio è imparziale. Valutare diapositive anonimi di due membri del laboratorio indipendente. Divulgare genotipi solo dopo che il conteggio è finito. </li></ol></li><li> Valutare il grado di malignità da un punteggio cieca di cervelli montati sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri GFP. Usare un pennarello per etichettare i cervelli che sono stati già visti al fine di evitare il doppio conteggio (Figura 3B). </li><li> Calcolare la percentuale di cervelli che rientrano in ciascuna delle categorie definite invasive per genotipo. Determinare le s statisticiignificance utilizzando un test chi-quadrato (Figura 3C). </li></ol> 7. Isolamento RNA, trattamento DNasi, e di verifica della qualità NOTA: tutti i reagenti (soluzioni, plasticware) utilizzato nelle seguenti fasi dovrebbe essere libero di attività RNasi. Indossare sempre guanti e utilizzare una cappa chimica per il lavoro con solventi organici. <ol><li> Trasferire il EAD pulita con un rivestimento punta P20 micropipetta in 1,5 ml tubo. </li><li> Let sink tessuto al fondo del tubo, rimuovere con attenzione PBS e sostituirlo con 100 microlitri di reagente di lisi RNA (sufficiente per fino a 140 EAD). </li><li> Lyse tessuto nel vortex. A questo punto, i campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C o direttamente trattati con un protocollo di isolamento di RNA standard. NOTA: I campioni di genotipi simili da vari cicli di dissezione possono essere raggruppati in una volta RNA reagente di lisi. </li><li> Riempire il volume del campione di 0,9 ml con il reagente RNA lisi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare campioni vigoroamente per 15-20 sec. </li><li> Dopo 2 a 3 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire incolore superiore fase acquosa contenente l&#39;RNA in una nuova provetta senza disturbare l&#39;interfase. Stare lontano dal interfase in quanto contiene proteine ​​e DNA genomico. NOTA: Il volume recuperato dovrebbe essere circa il 60% del volume di reagente RNA lisi utilizzato per omogeneizzazione. </li><li> Precipitare l&#39;RNA aggiungendo 0,5 ml di alcool isopropilico. Vortex e incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA, una volta con 600 ml di etanolo al 75%. Dopo un breve vortice e centrifugazione (10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C) scartare tutte etanolo e lasciare che il pellet di RNA asciugare per 5-10 min posizionare il tubo aperto su un tessuto panno pulito. NOTA: Il pellet di RNA potrebbe essere visibile come un piccolo opaco / bianco stmaturi sul fondo del tubo o invisibile. Le gocce di etanolo rimanenti possono essere accuratamente rimosso con la punta P10 micropipetta. </li><li> Sciogliere RNA in 50 ml di acqua DEPC trattati con il vortex o passando soluzione un paio di volte attraverso un puntale. </li><li> Per ridurre al minimo la contaminazione con il DNA genomico, il trattamento di RNA totale con DNasi con l&#39;aggiunta di 50 ml di una miscela contenente 1 ml di DNasi (2 U / mL) e 10 ml di 10x tampone DNasi in acqua DEPC-trattata. Vortex e spin down. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua o di un blocco di riscaldamento per 30 a 40 min. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 100 ml di acqua DEPC trattati in ogni campione. </li><li> Per inattivare l&#39;attività enzimatica e RNA pulita dal DNasi, aggiungere 200 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1), soluzione vortex per 1 min e centrifugare i campioni a 10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore contenente RNA in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale (200 ml)di cloroformio, mescolare e ripetere la fase di centrifugazione dall&#39;alto. </li><li> Raccogliere accuratamente la fase superiore e precipitare RNA aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 preparata in DEPC H 2 O e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare bene nel vortex. NOTA: L&#39;aggiunta di 0,5 ml di glicogeno (20 mg / mL) per un mix di precipitazione aiuta a visualizzare il pellet di RNA. Per ridurre al minimo la perdita di RNA, usare, tubi siliconate bassi vincolante 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Precipitare l&#39;RNA a -20 ° C per almeno 1 ora. NOTA: L&#39;incubazione può essere effettuata durante la notte. I campioni possono essere collocati a -80 ° C, come pure. </li><li> Pellet RNA mediante centrifugazione a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C. Lavare e asciugare pellet seguendo la descrizione in 7.9. </li><li> Sciogliere RNA in 10-15 ml di acqua DEPC trattati. RNA Conservare a -80 ° C. </li><li> Determinare la quantità e la purezza di RNA misurando OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Calcola RNA concentration applicando la convenzione che 1 OD a 260 nm è pari a 40 mg / ml di RNA. NOTA: Il rapporto A 260/280 di RNA &quot;puro&quot; equivale 2.0 mentre un rapporto A 260/230 dovrebbe essere nell&#39;intervallo 2.0-2.2. Campioni di RNA con un rapporto A 260/280 tra 1,7 e 2,0 sono adatti per applicazioni a valle come la sintesi del DNA. Per la preparazione di librerie mRNA-seq la qualità e la quantità di RNA dovrebbero essere controllati mediante un sistema di elettroforesi automatizzato. Il rapporto 28S / 18S deve essere superiore a 1,8. </li></ol>

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L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. 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K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing.">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging.">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

Le tecniche per generare mosaici genetici in Drosophila sono tra gli strumenti più sofisticati per l&#39;analisi e la manipolazione di funzione del gene 33. Il sistema eyFLP-MARCM ha dimostrato potente e robusto quanto consente l&#39;induzione di marcate visivamente, cloni geneticamente definiti in modo spazialmente ristretta, cioè, in tessuti dove enhancer eyeless è attivo 9,18. Ciò è particolarmente importante quando più lesioni genetiche sono combinati nelle stes...

Il cancro rappresenta uno dei gruppi più geneticamente eterogeneo di malattie, la cui incidenza e la mortalità è drammaticamente in aumento, in particolare tra gli anziani in tutto il mondo. Il cancro ha origine clonale da una cellula tumorale-inizio che sfugge meccanismi oncosoppressori intrinseca e divide fuori controllo. Il progressivo accumulo di lesioni genetiche che promuovono in cooperazione la crescita, la proliferazione e la motilità, mentre inibisce la morte e la differenziazione trasforma la crescita eccessiva benigna iniziale in un tumore altamente maligno, metastatico e mortale. È diventato evidente che, oltre ad alterazioni genetiche, progressione tumorale richiede cambiamenti nello stroma circostante e diafonia tra i tipi di tumore e multiple di cellule (ad esempio, fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) nel suo microambiente. La comprensione dei principi molecolari alla base la trasformazione maligna comprese le interazioni tumore-stroma è di grande importanza per lo sviluppo di prevenzionezione e screening precoce strategie, così come i trattamenti nuovi ed efficaci per combattere la metastasi del cancro e la resistenza ai farmaci. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema interessante per la ricerca sul cancro 1-4 grazie al suo tempo di generazione veloce, notevole risparmio di segnalazione nodi tra le mosche e gli esseri umani, limitati ridondanza genetica e la ricchezza di strumenti genetici avanzati che facilitano la manipolazione di quasi ogni gene in maniera limitata temporaneamente e spazialmente. Tumori geneticamente definite di varia malignità possono essere riproducibile progettati in Drosophila introducendo GAIN- e la perdita-di-funzione mutazioni in un sottogruppo di progenitori in un tessuto di tipo altrimenti selvaggio con la tecnica MARCM 5. Lo strumento MARCM combina FLP / FRT (FLP ricombinasi / FLP Target Recognition) mediata ricombinazione mitotica 6 con FLP-out 7 e GAL4 / UAS (Upstream sequenza di attivazione) del gene bersaglio 8sistemi di espressione 9. Con questo metodo l&#39;espressione di qualsiasi transgene UAS-based, tra cui oncogene o cDNA proteina fluorescente o ripetizioni di DNA invertite per silenziamento genico dsRNA-indotta, sarà limitato a un clone di cellule che hanno perso uno specifico locus genetico e un repressore GAL4 a causa di ricombinazione (Figura 1A). Patch clonali contrassegnati con verde fluorescente (GFP) o proteine fluorescenti rossi (ad esempio, RFP, DsRed, mCherry) può essere facilmente rintracciato durante lo sviluppo, isolato e analizzato. È importante sottolineare che il loro comportamento può essere direttamente confrontata con l&#39;adiacente tessuti wild type. Così, domande pertinenti alla cella effetti autonome e non autonome di lesioni genetiche possono essere studiati convenientemente. Simile a mammiferi, solo cloni in cui lesioni multiple oncogeni sono combinati diventano maligne in Drosophila e ricapitolano caratteristiche chiave del cancro mammiferi. Essi overproliferate, eludere l&#39;apoptosi, inducono l&#39;infiammazione, diventare immortale e Invasive, in ultima analisi, uccidendo l&#39;ospite 10-17. Qui, descriviamo un protocollo di generare tumori clonali geneticamente definite nel tessuto oculare / antenne e il cervello di Drosophila larve con la tecnica MARCM. Il metodo si basa su un tester magazzino MARCM che esprime la FLP ricombinasi lievito sotto il controllo del enhancer senza occhi (eyFLP) 18,19. In questo modo, cloni GFP-etichettata sono generati in funzione sia epitelio colonnare peripodial e della EAD e neuroepitelio del cervello durante le fasi embrionali e larvali (Figura 1A, B e di riferimento 20). I cloni possono essere facilmente seguiti fino all&#39;età adulta, come la EAD si sviluppa nella capsula occhio adulti, antenna e la testa mentre il neuroepitelio dà luogo a neuroblasti che producono differenziate neuroni del lobo ottiche. Per facilitare estesa caratterizzazione molecolare, funzionale e fenotipica del tessuto mosaico, si descrivano un protocollo per la dissezione del EAD e il cervello dalla terza larve instar e delineare come elaborarli per tre diverse applicazioni: (i) la rilevazione di reporter fluorescenti transgenici e immunostaining, (ii) la quantificazione di invasività tumorale e (iii) analisi dei espressione genica cambia utilizzando una quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) o di un high-throughput sequencing mRNA (mRNA-seq) (Figura 1C). Il protocollo immunostaining può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi proteina di interesse con un anticorpo specifico. Transgenici reporter trascrizionali fluorescenti forniscono informazioni spazio-temporale comodo e preciso sull&#39;attività di un particolare percorso di segnalazione. reporter specifici Cell-lignaggio, invece, riflettono i cambiamenti qualitativi e quantitativi in ​​popolazioni di cellule all&#39;interno del tessuto del mosaico e tra tumori genotipi distinti. La quantificazione del comportamento invasivo facilita il confronto delle malignità del tumore tra il genotipoS. Infine, il protocollo che descrive la raccolta e l&#39;elaborazione di EAD mosaico per l&#39;isolamento di RNA è adatto sia per applicazioni a valle piccola e grande scala, come trascrizione inversa seguita da rispettivamente qRT-PCR e di tutto il genoma mRNA-Seq,. I dati qualitativi e quantitativi ottenuti da questi test forniscono nuove intuizioni sul comportamento sociale dei tumori clonali. Inoltre, producono una solida base per studi funzionali sul ruolo dei singoli geni, le reti genetiche e microambiente tumorale in diverse fasi e gli aspetti della tumorigenesi.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&amp;uuml;rzm&amp;uuml;hle Brecht, Eggenstein, Germany</td><td>00262-0500</td><td>Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Corn syrup</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Soy flour</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-4-benzoate/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>H5501</td><td>Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila fly food vials</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Germany</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Vial plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fly food bottles</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Bottle plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CHOH-]&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>81381</td><td>Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39&amp;nbsp;ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50&amp;nbsp;&amp;deg;C and centrifuge 20&amp;nbsp;min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>158127</td><td>4% PFA fixative recipe: Dissolve 4&amp;nbsp;g PFA in 80 ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O on a magnetic stirrer plate heated to 55&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 &amp;micro;l Triton X-100 and fill up with Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml. Store aliquots at -20 &amp;deg;C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A3059</td><td>Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled phalloidin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 &amp;deg;C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335</td><td>DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store aliquots at 4 &amp;deg;C. Used in dilution 1:1,000 in PBST.</td></tr><tr><td>Mouse anti-H2 antibody</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass embryo dish (30&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&amp;auml;ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Precision Wipes</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera</td><td>Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>FV1000</td><td>Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20&amp;times; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&amp;times; UPlanFL (NA 1.30) and 60&amp;times; UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50&amp;nbsp;mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40&amp;nbsp;mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15&amp;nbsp;mW) and Red Laser diode 635 (20&amp;nbsp;mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Drosophila cooled incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td>&amp;nbsp;Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Squirt bottle</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Digital Rocking Shaker</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>2302700</td><td>The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D5758</td><td>Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, stir overnight and autoclave.</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&amp;micro;l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate trihydrate</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>27652.232</td><td>Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust the pH to 5.2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>100983</td><td>Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automated Electrophoresis Station</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>Prepare 100 &amp;micro;M stock solutions in DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France</td><td>4030</td><td>Store aliquots of 25 &amp;micro;l at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3&#039;</td></tr></tbody></table>

the drosophila imaginal disc tumor model: visualization and quantification of gene expression and tumor invasiveness using genetic mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Per dimostrare le potenzialità della tecnica eyFLP-MARCM per generare patch GFP-marcato su genotipi definiti in Drosophila EAD, sono stati indotti tre tipi di cloni: (1) il controllo che esprimono GFP solo, (2) tumori maligni che esprimono una forma oncogenica del piccolo G-proteina Ras (Ras V12) in un contesto di perdita omozigote di uno scarabocchio gene soppressore del tumore (Scrib 1) e (3) overgrowing ma non invasivo ras V12...

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l&#39;invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

11.0K Views.  University of Cologne.  Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore. 

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue organization. Drosophila melanogaster has emerged as a popular experimental model system in cancer biology to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. In particular, genetic tools for Drosophila imaginal discs (developing epithelia in larvae) enable the creation of transformed pro-tumor cells within a normal epithelial tissue, a situation similar to the initial stages of human cancer. A recent study of tumorigenesis in Drosophila wing imaginal discs, however, showed that tumor initiation depends on the tissue-intrinsic cytoarchitecture and the local microenvironment, suggesting that it is important to consider the region-specific susceptibility to tumorigenic stimuli in evaluating tumor phenotypes in imaginal discs. To facilitate phenotypic analysis of tumor progression in imaginal discs, here we describe a protocol for genetic experiments using the GAL4-UAS system to induce neoplastic tumors in wing imaginal discs. We further introduce a diagnosis method to classify the phenotypes of clonal lesions induced in imaginal epithelia, as a clear classification method to discriminate various stages of tumor progression (such as hyperplasia, dysplasia, or neoplasia) had not been described before. These methods might be broadly applicable to the clonal analysis of tumor phenotypes in various organs in Drosophila.

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Mosaic clone analysis in Drosophila imaginal disc epithelia is a powerful model system to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. Here we describe a protocol to induce tumors in Drosophila wing imaginal discs using the GAL4-UAS system, and introduce a diagnosis method to classify the tumor phenotypes.

Induzione e diagnosi dei tumori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Ricerca sul cancro

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Neuroscienze

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

Allotrapianto tumorale in Drosophila melanogaster con iniettore auto-nanolitro programmabile

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Medicina

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Biologia

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Un modello di Drosophila per studiare la poliploidizzazione indotta dalle ferite

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; cellule fotorecettrici

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Il

Riepilogo

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Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

Induzione e diagnosi dei tumori in

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Allotrapianto tumorale in Drosophila melanogaster con iniettore auto-nanolitro programmabile

Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Un modello di Drosophila per studiare la poliploidizzazione indotta dalle ferite

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da