Questo protocollo consentirà ai ricercatori di sfruttare gli strumenti chimici e genetici disponibili per studiare i meccanismi di rigenerazione epatica nel pesce zebra. L'epatomia parziale consente la rimozione precisa dei tessuti per stimolare la rigenerazione epatica senza la necessità degli effetti a livello corporeo di lesioni epatiche tossiche. Solo comprendendo i meccanismi molecolari e cellulari di rigenerazione epatica possiamo progettare nuove terapie per trattare pazienti con malattie epatiche avanzate.
Per iniziare, rimuovere il pesce dal serbatoio di Tricaine usando le forcep e incorporarli nel solco di una spugna imbevuta di Tricaine con il lato ventrale verso l'alto. Quindi posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso. Pizzicare la pelle e le squame appena posteriori al cuore con forcep fini e creare un buco nella cavità corporea facendo un taglio sotto le forcep con la forbice caricata a molla.
Ruotare la spugna e fare un'incisione da tre a quattro millimetri lungo l'addome tagliando posterialmente verso le pinne pelviche. Quindi ruotare la spugna indietro. Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea.
Il lobo ventrale del fegato è presente sopra l'intestino e il fegato è una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino marrone dorato e può essere chiaramente visualizzato con la fluorescenza CFP. Spremere le forcep fini in modo che i denti si tocchino a vicenda e far scorrere i denti tra il fegato e l'intestino. Quindi separare lentamente i denti per rompere gli attacchi delle vene portale tra il fegato e l'intestino.
Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino sono state recise e estrarre il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini. Tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato. L'esame dell'animale con fluorescenza CFP dimostra che il lobo ventrale è stato rimosso.
Al termine, trasferire attentamente il pesce dalla spugna nel serbatoio contenente acqua del sistema e trasmettere l'acqua del sistema sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce non si riprende e nuota da solo. Dopo aver eutanasiato il pesce, rimuoverlo dall'acqua ghiacciata. Posizionarlo nella scanalatura di una spugna con il lato ventrale verso l'alto e fare un'incisione della parete del corpo ventrale nella posizione posteriore anteriore del cuore.
Quindi fare altre due incisioni dai bordi della prima incisione che corrono lungo l'asse posteriore anteriore alle pinne pelviche e sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali. Gli organi viscerali possono ora essere visualizzati sia con il campo luminoso che con la microscopia a fluorescenza. Il recupero del fegato dopo l'epatomia parziale è stato stimato calcolando il rapporto fegato/peso corporeo, che era dell'1,8% per i maschi e del 3,3% per le femmine.
Il rapporto fegato/peso corporeo di entrambi i sessi è stato determinato al giorno zero post-intervento e al settimo giorno in epatectomia parziale e controlli fittizi. Al giorno zero post-intervento chirurgico, gli animali fittizi hanno un lobo ventrale visibile, ma negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale era completamente assente, il che ha comportato una riduzione del 30% dei maschi e del 20% delle femmine dei rapporti fegato/peso corporeo. Al settimo giorno post-intervento chirurgico negli animali dell'epatomia parziale, il lobo ventrale non è stato rigenerato e i rapporti fegato/peso corporeo in epatomia parziale e controlli fittizi erano comparabili, indicando la massa epatica riconquistata dopo l'epatomia parziale.
L'effetto del tempo sulla rigenerazione del lobo ventrale è stato determinato eseguendo un'epatectomia parziale completa di 1/3 e misurando il lobo ventrale al rapporto lunghezza intestino. Il lobo ventrale occupava dal 50 al 100% della lunghezza dell'intestino nei controlli fittizi, ma è stato gravemente ridotto in 1/3 animali epatectomia parziale. Gli animali dell'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 hanno avuto un aumento del rapporto lobo ventrale/intestino rispetto al primo giorno post-intervento chirurgico.
Un aumento statisticamente significativo delle dimensioni del lobo ventrale è stato osservato negli animali che si stanno riprendendo dall'epatomia parziale nel giorno post-intervento 36 rispetto al primo giorno, ma non nei controlli fittizi. Alcuni animali hanno rigenerato il lobo ventrale, ma alcuni no, indicando variazioni nella risposta chirurgica. La parte più critica di questo protocollo è separare in modo pulito il fegato e l'intestino in modo che il lobo ventrale possa essere completamente rimosso.
L'epatomia parziale nel pesce zebra può essere eseguita in linee mutanti o transgeniche per dire che il fabbisogno genetico per la rigenerazione epatica.
