Questo protocollo può migliorare significativamente l'espansione delle cellule NK funzionali, non esaustive, simili alla memoria ex vivo rispetto ad altre celle di alimentazione basate sul sistema di espansione. Questo è un metodo più semplice rispetto ad altri protocolli che utilizzano celle di alimentazione in cui saltiamo la fase di isolamento delle cellule NK prima dell'espansione delle cellule NK. Questo protocollo può fornire un numero sufficiente di cellule NK e CAR-NK per l'immunoterapia.
Questa tecnica è altamente riproducibile. Tuttavia, utilizzare nuovi materiali di partenza freschi e fare attenzione a non disturbare le cellule NK durante i primi giorni di espansione è fondamentale. Inizia identificando e sezionando le aree di tessuto vitale utilizzando attrezzature chirurgiche sterili per ottenere linfociti.
Quindi, posizionare i tessuti sezionati in 30 millilitri di HBSS senza calcio o magnesio e mantenere il tessuto sul ghiaccio fino al momento dell'isolamento. Lavorando all'interno di un armadio di biosicurezza, tritare il tessuto in cubetti di meno di 0,5 centimetri con lamette e pinze sterili. Posizionare i pezzi di tessuto tritato, non più di 4 grammi, nei tubi del dissociatore tissutale e aggiungere 10 millilitri di collagenasi IV ai pezzi di tessuto.
Per tritare accuratamente il tessuto, trattare i tubi del dissociatore tissutale in un dissociatore tissutale a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso i tubi dal dissociatore tissutale, triturare il tessuto tritato attraverso un filtro a cellule di nylon da 40 micron utilizzando il backend di una siringa da 5 millilitri. Scartare i grandi frammenti non digeriti.
Girare l'eluente raccolto a 400G per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante prima di risospendere i pellet cellulari in silice rivestita di polivinilpirrolidone al 30% per rimuovere le cellule adipose. Ruotare le cellule come descritto prima di risospendere il pellet cellulare in 9 millilitri di mezzi R-10. Per separare i linfociti dai globuli rossi e dalle cellule polimorfonucleate, stratificare attentamente la sospensione cellulare su 4 millilitri di Ficoll o mezzi di separazione dei linfociti.
Separare gli strati centrifugando a 400G per 23 minuti a temperatura ambiente con l'accelerazione e i freni spenti. Quindi, decantare con cura lo strato medio-superiore e raccogliere l'interfase contenente linfociti infiltranti i tessuti. Risciacquare le cellule con 10 millilitri di terreno e procedere per l'analisi o il protocollo di espansione delle cellule natural killer primario, o NK.
Lavare separatamente le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, e 100 cellule 221-mIL-21 irradiate con raggi gamma mediante centrifugazione a 400G per 5 minuti con 10 millilitri di terreno R-10. Dopo la centrifugazione, conservare 1 x 10 al 6° PBMC per la citometria a flusso e mescolare 5 x 10 al 6° PBMC con 10 x 10 al 6° 100 cellule 221-mIL-21 irradiate con raggi gamma in una speciale piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 30 millilitri di mezzi R-10 integrati con interleuchina-2 umana e interleuchina-15 umana alla stessa piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, con la sostituzione del mezzo ogni 3 o 4 giorni.
Durante l'incubazione, registrare la vitalità totale del numero di cellule del natural killer del sangue periferico, o PBNK, ed eseguire la citometria a flusso ogni 3 o 4 giorni per calcolare il tasso di espansione delle cellule NK. Aggiungere 1,8 x 10 alla 6a cella 293T in 11 millilitri di terreno D-10 per piastra da 100 millimetri trattata e incubare 293T cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. In un tubo da 1,70 millilitri, mescolare 470 microlitri del mezzo sierico ridotto con 30 microlitri del reagente di trasfezione.
In un tubo separato da 1,70 millilitri, aggiungere 2,5 microgrammi di plasmide pRDF, 3,75 microgrammi di plasmide Pegpam3 e 2,5 microgrammi di costrutto CAR nel vettore SFG nel mezzo sierico ridotto per ottenere il volume finale di 500 microlitri. Mescolare il contenuto del tubo con il tubo da 1,70 millilitri preparato in precedenza in modo goccia a goccia. Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere 1 millilitro della miscela dal tubo alla piastra cellulare 293T in modo goccia a goccia e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48-72 ore.
Diluire la proteina retronectina con PBS ad una concentrazione finale da 50 a 100 microgrammi per millilitro. Aggiungere 500 microlitri di retronectina diluita in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non trattata. Quindi, sigillare la piastra usando il parafilm e incubare la piastra a 4 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, centrifugare la piastra retronectina a 2, 103G per 30 minuti a 4 gradi Celsius e scartare il surnatante. Dopo aver bloccato ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 1 millilitro di mezzo R-10, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 1 ora. Filtrare le cellule 293T precedentemente trasfettate utilizzando un filtro da 0,45 micron per raccogliere il supernatante del retrovirus.
Aliquot 2 millilitri del supernatante retrovirus filtrato in ciascun pozzetto della piastra di retronectina a 24 pozzetti. Centrifugare la piastra retronectina a 24 pozzetti a 2, 103G per 2 ore in una centrifuga preriscaldata a 32 gradi Celsius. Mentre le piastre vengono centrifugate, raccogliere le celle PBNK espanse dal giorno 0 e contare le cellule usando Trypan Blue.
Diluire le cellule PBNK espanse con terreni R-10 integrati con interleuchina-2 e interleuchina-15 alla concentrazione di 2,5 x 10 al 5 ° a 5 x 10 alle 5 cellule per millilitro. Dopo la centrifugazione della piastra di retronectina a 24 pozzetti, aspirare parzialmente il supernatante del retrovirus da ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 2 millilitri delle celle PBNK espanse diluite a ciascun pozzetto.
Centrifugare la piastra a 600G per 10 minuti a 32 gradi Celsius prima di incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48-72 ore. Trasferire le celle dalla piastra a 24 pozzetti in un tubo da centrifuga da 50 millilitri per centrifugare il tubo a 400G per 5 minuti. Dopo aver risospeso il pellet con 1 millilitro di mezzo R-10, trasferire le celle risospese su una speciale piastra a 6 pozzetti contenente 30 millilitri di mezzi R-10 integrati con interleuchina-2 e interleuchina-15.
Incubare la speciale piastra a 6 pozzetti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con mezzi rinfrescanti e calcolare il tasso di espansione delle cellule NK ogni 3 o 4 giorni. Le celle PBNK espanse di 221-mIL-21 hanno dimostrato di espandersi di quasi 5 x 10 fino al 4 ° ripiego. E la purezza delle cellule NK è stata mantenuta a circa l'85% durante l'espansione di 21 giorni.
Prima dell'espansione, la robustezza del sistema di espansione 221-mIL-21 è stata esaminata colorando le PBMC per anti-CD56 e anti-CD3, che hanno mostrato una purezza cellulare del 7,09% per le cellule NK e un'alta percentuale di cellule T. Il giorno 4 delle PBMC e della cocultura 221-mIL-21, la purezza NK è stata controllata prima della trasduzione CAR-NK. Le cellule CAR-NK colorate per anti-CD56, anti-CD3 e anti-IgG umane hanno mostrato un'elevata popolazione di cellule NK al giorno 7 ed è stata osservata un'elevata efficienza di trasduzione CAR di circa il 70%.
Il 18 ° giorno, l'espressione di CAR in vari sottogruppi è stata controllata con citometria a flusso. Dopo l'espansione delle cellule NK, le cellule possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro o per esperimenti in vivo. Il ricercatore può utilizzare questo protocollo per espandere NK e CAR-NK per i pazienti con deficit funzionale di NK e altre specie, come il cane.
