פרוטוקול זה יכול לשפר באופן משמעותי את ההתרחבות של תאי NK פונקציונליים, לא ממצים, דמויי זיכרון ex vivo בהשוואה לתאי הזנה אחרים המבוססים על מערכת הרחבה. זוהי שיטה פשוטה יותר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בתאי הזנה שבהם אנו מדלגים על שלב בידוד תאי NK לפני הרחבת תאי NK. פרוטוקול זה יכול לספק מספר מספיק של תא NK ו- CAR-NK לאימונותרפיה.
טכניקה זו ניתנת לשחזור רב. עם זאת, שימוש בחומרי התחלה חדשים ורעננים והקפדה שלא להפריע לתאי ה-NK בימים הראשונים של ההתרחבות הם חיוניים. התחל על ידי זיהוי וחתך של אזורי רקמות קיימא באמצעות ציוד כירורגי סטרילי כדי להשיג לימפוציטים.
לאחר מכן, מניחים את הרקמות החתוכות ב -30 מיליליטר של HBSS ללא סידן או מגנזיום ושומרים את הרקמה על הקרח עד שהיא מוכנה לבידוד. בעבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית, טחנו את הרקמה לקוביות של פחות מ-0.5 ס"מ עם סכיני גילוח ומלקחיים סטריליים. מניחים את חתיכות הרקמה הטחונה, לא יותר מ 4 גרם, בצינורות dissociator רקמות ולהוסיף 10 מיליליטר של collagenase IV לחתיכות הרקמה.
כדי לטחון את הרקמה ביסודיות, יש לטפל בצינורות הדיסוציאציה של הרקמה לתוך דיסוציאטור של רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הצינורות מדיסוציאטור הרקמה, טריטורט הרקמה הטחונה דרך מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרון באמצעות הקצה האחורי של מזרק 5 מיליליטר. השליכו את השברים הגדולים והלא מעוכלים.
סובבו את ה-eluent שנאסף ב-400G למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ושאפו את ה-supernatant לפני החייאת כדורי התא בסיליקה מצופה 30% פוליוויניל פירולידון כדי להסיר את תאי השומן. סובבו את התאים כפי שתואר לפני החייאת גלולת התא ב-9 מיליליטר של מדיית R-10. כדי להפריד לימפוציטים מתאי דם אדומים ותאים פולימורפו-גרעיניים, שכבה בזהירות את ההשעיה התאית מעל 4 מיליליטר של פיקול או מדיה הפרדת לימפוציטים.
הפרידו את השכבות על ידי צנטריפוגה ב-400G למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר עם ההאצה והבלמים כבויים. לאחר מכן, בזהירות decant את השכבה העליונה-בינונית ולקצור את interphase המכיל לימפוציטים חודרים רקמות. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של מדיה ולהמשיך לניתוח או הרג טבעי ראשוני, או NK, פרוטוקול הרחבת תאים.
יש לשטוף את תאי הדם החד-גרעיניים ההיקפיים, או PBMCs, ו-100 תאי 221-mIL-21 המוקרנים בגמא בנפרד על ידי צנטריפוגה ב-400G למשך 5 דקות עם 10 מיליליטר של מדיית R-10. לאחר צנטריפוגה, שמור 1 x 10 ל- PBMCs ה -6 עבור ציטומטריית זרימה וערבב 5 x 10 ל- PBMCs ה -6 עם 10 x 10 ל- 6 100 תאים מוקרנים גמא 221-mIL-21 בלוח מיוחד של 6 בארות. הוסף 30 מיליליטר של מדיה R-10 בתוספת אינטרלוקין-2 אנושי ואינטרלוקין-15 אנושי לאותה צלחת 6 בארות ודגירה של הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, עם החלפת המדיה כל 3 עד 4 ימים.
בזמן הדגירה, רשום את ההרג הטבעי הכולל של הדם ההיקפי, או PBNK, את הכדאיות של מספר התאים ובצע ציטומטריה של זרימה כל 3 עד 4 ימים כדי לחשב את קצב התפשטות תאי ה- NK. הוסף 1.8 x 10 לתאי 293T השישיים ב-11 מיליליטר של מדיית D-10 לכל צלחת 100 מילימטר מטופלת ודגירה של 293T תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. בצינור של 1.70 מיליליטר, יש לערבב 470 מיקרוליטרים של מדיית הסרום המופחתת עם 30 מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה.
בצינור נפרד של 1.70 מיליליטר, הוסף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד pRDF, 3.75 מיקרוגרם של פלסמיד Pegpam3, ו -2.5 מיקרוגרם של מבנה CAR בווקטור SFG לתוך מדיית הסרום המופחתת כדי להפוך את הנפח הסופי של 500 מיקרוליטר. מערבבים את תכולת הצינור עם שפופרת 1.70 מיליליטר שהוכנה קודם לכן בצורה טיפתית. לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, הוסיפו מיליליטר אחד של התערובת מהצינור לצלחת תאי 293T בצורה טיפה והניחו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות.
דלל את חלבון הרטרונקטין עם PBS לריכוז סופי של 50 עד 100 מיקרוגרם למיליליטר. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של הרטרונקטין המדולל לכל באר של צלחת 24 בארות לא מטופלת. לאחר מכן, אטמו את הצלחת באמצעות פרפילם ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, צנטריפוגה צלחת retronectin ב 2, 103G במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לאחר חסימת כל באר של צלחת 24 באר עם 1 מיליליטר של R-10 בינוני, לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 1 שעה. סנן את תאי ה-293T שעברו טרנספקציה בעבר באמצעות מסנן של 0.45 מיקרון כדי לאסוף את הרטרו-וירוס.
Aliquot 2 מיליליטר של supernatant retrovirus מסונן לתוך כל באר של צלחת retronectin 24 היטב. צנטריפוגה צלחת retronectin 24 באר ב 2, 103G במשך 2 שעות לתוך צנטריפוגה מחוממת מראש ב 32 מעלות צלזיוס. בזמן שהלוחות עוברים צנטריפוגה, אספו את תאי ה-PBNK המורחבים מיום 0 וספרו את התאים באמצעות Trypan Blue.
דלל את תאי ה-PBNK המורחבים עם מדיית R-10 בתוספת אינטרלוקין-2 ואינטרלוקין-15 לריכוז של 2.5 x 10 עד 5 x 10 לתאים החמישים למיליליטר. לאחר צנטריפוגה של צלחת retronectin 24 באר, לשאוף חלקית את supernatant retrovirus מכל באר. לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של תאי PBNK מורחבים מדולל לכל באר.
צנטריפוגה של הצלחת ב-600G למשך 10 דקות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס לפני דגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 עד 72 שעות. העבירו את התאים מצלחת 24 הבאר לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר כדי לבצע צנטריפוגה של הצינור ב-400G למשך 5 דקות. לאחר החייאת הכדור עם 1 מיליליטר של מדיה R-10, להעביר את התאים החייאה לצלחת מיוחדת 6-באר המכילה 30 מיליליטר של מדיה R-10 בתוספת אינטרלוקין-2 ואינטרלוקין-15.
דגירה של צלחת מיוחדת של 6 בארות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עם מדיה מרעננת וחשב את קצב התפשטות תאי ה-NK כל 3 עד 4 ימים. תאי ה-PBNK שהורחבו ב-221-mIL-21 הראו שהם מתרחבים בכמעט 5 על 10 לקפלים הרביעיים. וטוהר תאי ה-NK נשמר בכ-85% לאורך כל 21 ימי ההתרחבות.
לפני ההתרחבות, החוסן של מערכת ההתפשטות 221-mIL-21 נבדק על ידי צביעת PBMCs עבור אנטי-CD56 ואנטי-CD3, אשר הראו טוהר תאים של 7.09% עבור תאי NK ואחוז גבוה של תאי T. ביום 4 של PBMCs ו 221-mIL-21 coculture, טוהר NK נבדק לפני התמרה CAR-NK. תאי CAR-NK המוכתמים עבור אנטי-CD56, אנטי-CD3 ואנטי-אדם-IgG הראו אוכלוסיית תאי NK גבוהה ביום 7 ונצפתה יעילות התמרת CAR גבוהה של כ-70%.
ביום ה -18, הביטוי CAR בתת-קבוצות שונות נבדק עם ציטומטריה של זרימה. לאחר הרחבת תאי NK, תאים יכולים לשמש למבחנים פונקציונליים במבחנה או לניסויים in-vivo. חוקר יכול להשתמש בפרוטוקול זה כדי להרחיב את NK ו- CAR-NK עבור חולים עם מחסור תפקודי ב- NK, כמו גם מינים אחרים, כגון כלב.
