Questo metodo rende possibile l'imaging criografico a super risoluzione su intere cellule biologiche per identificare con precisione le strutture cellulari. Può anche essere utilizzato in combinazione con altre modalità come parte di un flusso di lavoro di imaging correlativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che l'imaging a super risoluzione può essere eseguito rapidamente in condizioni criogeniche utilizzando fluorofori convenzionali e dosi di luce relativamente basse.
CyroSIM è un potente strumento che fornisce informazioni per comprendere le dinamiche dell'ultrastruttura cellulare in risposta a segnali interni o esterni. La sua applicazione include la produzione e il lancio di vaccini, il controllo di qualità, la sorveglianza post-commercializzazione, l'ingegneria e l'ottimizzazione degli anticorpi, nonché la caratterizzazione delle nanoparticelle. La manovra dei campioni all'interno della fase crio-mo richiede pratica per garantire la sicurezza della griglia.
È anche meglio familiarizzare con i controlli nella finestra Cockpit prima della raccolta dei dati. Per iniziare, rimuovere il coperchio dal Dewar esterno del criostadio e versare azoto liquido filtrato fino a quando non è pieno di circa un quarto. Attendere che l'ebollizione iniziale si plachi prima di versare di più e riempire la nave a circa due terzi piena.
Sostituire il coperchio con attenzione, puntando l'ugello lontano dal gestore mentre l'azoto liquido bolle. Una volta che l'azoto liquido ha smesso di uscire dall'uscita, posizionare il tubo di uscita sopra il palco Dewar sul criostadio. Collegare la fonte di alimentazione, collegare il cavo USB e collegare il Dewar esterno al palco.
Dopo la somministrazione di azoto liquido, premere il pulsante di rilascio sul criostadio per consentirne l'ingresso nella camera del campione e attendere da 30 a 45 minuti affinché il sistema si raffreddi e si stabilizzi prima di iniziare con l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare la chiave esadecimale sullo strumento cassetta per aprire le due piastre della cassetta di trasferimento del campione. Aprire le piastre abbastanza larghe da far cadere la griglia tra le due piastre, ma non aprirsi nella posizione massima.
Utilizzare una pinza lunga per sollevare la scatola della griglia del campione dall'azoto liquido. Ruotalo in modo che la tacca si allinei con la posizione di archiviazione all'interno del palco e posizionalo sul palco. Utilizzare il dispositivo appropriato per aprire il coperchio della scatola di stoccaggio nella posizione corretta del campione.
Utilizzando una pinna invertita, rimuovere la griglia TEM dal portasempio, immergerla all'interno dell'azoto liquido assicurando che il lato del film di carbonio sia posizionato in modo che alla fine sia rivolto verso l'obiettivo sul ponte del campione e lasciarlo cadere in posizione nella cassetta di trasferimento del campione. Chiudere la cartuccia campione utilizzando il tasto esadecimale sullo strumento cassetta. Utilizzare il punto magnetico sullo strumento cassetta per sollevare e montare la cartuccia contenente la griglia sul ponte campione.
Tenerlo immerso o vicino all'azoto liquido e nel corretto orientamento. Posizionare la cassetta piatta all'interno dei perni di posizionamento del ponte e spingerla delicatamente per assicurarsi che sia fissa. Chiudere e rimuovere la scatola di stoccaggio insieme a tutti i campioni rimanenti.
Spostare il coperchio del criostadio aprendosi nella posizione di imaging e spegnere la luce della camera del campione. Far scorrere il palco verso l'ottica per allinearlo sotto la lente dell'obiettivo, quindi far cadere delicatamente l'obiettivo in posizione usando la leva, assicurandosi che riposi all'interno del coperchio del criostadio, ma non lo tocchi. Coprire il palco e l'ottica con una tenda nera opaca, quindi avviare il software di controllo Cockpit sul PC cryoSIM. Fare clic sul pulsante della modalità di lettura per ogni telecamera e impostarla su CONV3 megahertz.
Verificare che la temperatura di ogni telecamera sia di 80 gradi Celsius e che la ventola della fotocamera sia spenta. Accendi la fotocamera riflessa, sotto la luce, scegli ambiente e sotto linkam, controlla il condensatore, quindi fai clic sul pulsante della modalità video. Nella finestra Visualizzazione mosaico, eseguite lo zoom indietro per visualizzare il contorno della griglia.
Fare clic su Trova stage se non può essere visto e centrare la griglia facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse al centro del cerchio. Utilizzare i tasti su e giù per mettere a fuoco il campione fino a quando la pellicola di supporto della griglia o qualsiasi altra caratteristica pertinente è a fuoco. Utilizzare i nove e tre tasti sul tastierino numerico per modificare il passo Z.
Una volta centrato il palco, disattiva la modalità video. Raccogli un mosaico a luce visibile facendo clic su Esegui mosaico nella vista mosaico per produrre tessere di immagini a luce visibile che si diseggiano a spirale verso l'esterno dal centro. Salvare la vista facendo clic su Salva mosaico.
Ispeziona il mosaico a campo luminoso insieme a qualsiasi precedente immagine della mappa di fluorescenza spegnendo la luce ambientale e il condensatore e la modalità video, quindi accendi il laser di eccitazione richiesto e scegli la fotocamera e il filtro corrispondenti, inizialmente a 50 milliwatt per un tempo di esposizione di 50 millisecondi. Premere zero per scattare un'immagine e una stella per il contrasto automatico. In alternativa, regola manualmente il contrasto utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell'immagine.
Una volta trovate cellule biologicamente interessanti con fluorescenza adatta, contrassegnare le loro posizioni utilizzando il pulsante del sito di marcatura nella vista Mosaico. Continua a contrassegnare tutti i potenziali siti prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. Salvare di risalvataggio del mosaico con i siti contrassegnati facendo clic su Salva siti su file.
Per cucire l'immagine del mosaico utilizzando il software stitchEm, trascinare e rilasciare il file di mosaico di testo nel file stitchEm con l'estensione BAT e salvare l'immagine TIF combinata delle tessere di mosaico nella stessa cartella. Per salvare un'immagine con i siti contrassegnati, trascinare e rilasciare contemporaneamente il file di testo mosaico e il file di testo dei marcatori nell'icona. Impostare il tempo di esposizione laser in base ai conteggi e alla gamma dinamica nell'immagine a fluorescenza nella parte inferiore della finestra di visualizzazione della fotocamera.
Scegli quale filtro applicare e ottimizza le impostazioni per ogni lunghezza d'onda della luce di eccitazione da utilizzare, accendendo ciascun laser separatamente. Fare clic su entrambe le fotocamere per accenderle. Tornare a uno dei siti contrassegnati e concentrarsi nuovamente sulla profondità desiderata.
Una volta a fuoco in un'area di interesse, spostati fuori fuoco usando il tasto freccia su nella finestra XY sullo stage macro per scegliere l'altezza dello Z-stack da acquisire e fai clic su Salva in alto. Spostati fuori fuoco utilizzando il tasto freccia giù, clicca su Salva in basso, poi su Vai al centro, verifica che l'immagine sia ancora a fuoco. Nella finestra Cockpit selezionare Esperimento a sito singolo.
Dall'elenco a discesa selezionare Illuminazione strutturata. Modificare l'altezza della pila in modo che sia uguale all'altezza Z più un micrometro. Immettere i tempi di esposizione in millisecondi per i laser a 405 e 488 nanometri nella riga superiore per la fotocamera riflessa e i tempi di esposizione per i laser a 561 e 647 nanometri nella riga inferiore per la fotocamera trasmessa.
Inserisci un nome file e fai clic su Aggiorna per produrre un nuovo file contenente la data e l'ora senza sovrascrivere i file precedenti, quindi fai clic su Avvia. Se l'azoto liquido Dewar ricarica lo stadio crio durante l'acquisizione dell'immagine, interrompere il processo facendo clic sul pulsante ABORT nel software Cockpit. In ogni posizione, raccogliere uno Z-stack utilizzando la luce visibile spegnendo i laser e accendendo la luce ambientale e il condensatore.
In Esperimento a sito singolo, selezionare Z-stack e impostare la luce ambientale su un'esposizione di 20 millisecondi, mantenendo l'altezza Z. Ripetere questa procedura per tutti i siti contrassegnati. Al termine dell'imaging, sganciare lo stadio e rimuovere tutti i campioni.
Spegnere la spia della camera campione. Scollegare il Dewar esterno e decantare l'azoto liquido rimanente in un altro contenitore criocompatibili, consentendo al Dewar di tornare in sicurezza a una temperatura normale. Attendere fino a quando l'opzione per cuocere il display crio-stadio diventa disponibile dopo che non rimane più azoto liquido nello stadio Dewar.
Premere il pulsante bake out per accedere alla modalità di riscaldamento. Metti il tappo del coperchio sul criostadio. La risoluzione in crioSIM è significativamente superiore a quella della microscopia a epifluorescenza standard.
La mappa di fluorescenza di un microscopio a epifluorescenza convenzionale può essere utilizzata per individuare le aree di interesse per l'imaging e l'immagine crioSIM corrispondente può essere ottenuta da una posizione sulla griglia. Un campione contenente cellule U2OS è stato colorato con una miscela di colorante citoscheletrico a microtubuli verdi e colorante mitocondriale rosso con conseguente colorazione della componente microtubulica del citoscheletro e dei mitocondri. L'imaging successivo ha mostrato la localizzazione dei mitocondri all'interno della cellula, così come la disposizione dei microtubuli, evidenziando il quadro strutturale che forniscono alla cellula e l'assemblaggio del citoscheletro attorno agli organelli.
Il processo di ricostruzione della SIM può produrre artefatti che possono essere identificati utilizzando SIMCheck, un plugin gratuito imageJ. Questa mappa di contrasto di modulazione generata utilizzando SIMCheck mostra aree di basso contrasto di modulazione all'interno dell'area del nucleo, indicando che questa regione sarà più suscettibile agli artefatti di ricostruzione. La freccia bianca indica un artefatto di ricostruzione.
Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che il campione rimanga sempre sommerso o vicino all'azoto liquido per evitare la de-vetrificazione. Prestare attenzione anche ai tempi di esposizione e ai conteggi nella gamma dinamica, poiché ciò influisce sulla qualità dei dati ed evita danni laser al campione. Dopo l'imaging crio, gli stessi campioni possono essere ripresi con altre modalità come la tomografia a raggi X crio-morbida, che abbiamo qui alla B24 Beamline.
Combinando immagini crioSIM con immagini contenenti informazioni strutturali sulla cellula, possiamo rispondere a domande aggiuntive chiave sull'ultrastruttura e la funzione cellulare.
