Questo protocollo descrive un processo sperimentale passo-passo e un algoritmo matematico per quantificare la FRET utilizzando la tempra del donatore e l'emissione sensibilizzata all'accettore. La quantificazione delle efficienze FRET nella cellula vivente richiede la determinazione della diafonia delle proteine fluorescenti e delle relative efficienze di emissione e rilevazione dei fluorofori nella configurazione microscopica. La diafonia può essere valutata mediante imaging di cellule che esprimono un solo fluoroforo.
La valutazione dell'efficienza di rilevazione di una molecola donatrice o accettore richiede la conoscenza del rapporto tra il numero di molecole donatrici e accettori che danno origine al segnale di misura. Il numero di fluorofori espressi nelle cellule vive varia da cellula a cellula ed è sconosciuto. La sonda di calibrazione utilizzata in questo metodo, una proteina di fusione donatore-accettore uno-a-uno, consente di determinare l'efficienza di rilevazione relativa delle molecole donatore e accettore.
Per iniziare, utilizzare un vettore di espressione cellulare di mammifero N1 con mCherry 1 per generare la sonda di fusione EGFP mCherry 1. Progettare oligonucleotidi per amplificare EGFP senza un codone di stop come un frammento di cellula BAM h1. Il legame di cinque aminoacidi tra la proteina fluorescente verde e rossa dovrebbe produrre un deficit medio di FRET per la coppia donatore-accettore di ciliegie GFP da 0,25 a 0,3.
Utilizzare qualsiasi linea cellulare e mezzo senza rosso fenolo per ridurre la fluorescenza di fondo. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, staccarle con un millilitro di 0,05% di tripsina EDTA e seminare circa 10.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a otto pozzetti aggiungendo tre gocce da una sospensione cellulare da cinque millilitri. 24 ore dopo la placcatura, trasfettare le cellule utilizzando un mezzo di trasfezione appropriato.
Incubare le cellule per 20 ore prima dell'imaging delle cellule vive per consentire una corretta espressione, ripiegamento e maturazione delle proteine fluorescenti. Immagina le cellule in una camera ambientale umidificata e riscaldata a 37 gradi Celsius con un microscopio a scansione confocale. Per tamponare i mezzi cellulari a pH fisiologico, aggiungere 20 millimolari HEPES per rendere il mezzo cellulare indipendente dall'anidride carbonica.
Quindi montare il vetrino sul microscopio. Utilizzare la linea a 488 nanometri del laser agli ioni di argon per eccitare la GFP e il laser a diodi a 561 nanometri per eccitare la ciliegia. Impostare il laser a 488 nanometri per l'eccitazione nel canale uno attraverso una banda di emissione da 505 a 530 nanometri e nel canale due con un filtro a passaggio lungo di oltre 585 nanometri.
Utilizzare il laser a 561 nanometri per l'eccitazione nel canale tre con un filtro a passaggio lungo di oltre 585 nanometri. Eccitare i due laser in sequenza e impostare la modalità di imaging in modo che passi dopo ogni linea in modo che l'eccitazione dell'immagine da 512 x 512 pixel si alterni dopo ogni linea. Impostare una mini serie temporale di tre immagini per rilevare se si verifica un significativo photobleaching e ridurre la potenza del laser, se necessario.
In primo luogo, le cellule dell'immagine che esprimono il costrutto di fusione delle ciliegie GFP. Impostare i parametri che definiscono l'intensità del laser integrata nel tempo per pixel in un'immagine confocale. Usa un obiettivo olio 63X e lo zoom impostato su 3X per visualizzare una cella nella sua interezza con ingrandimento e risoluzione sufficienti.
Punta a una dimensione dei pixel da 70 a 80 nanometri. Impostare il tempo di permanenza dei pixel da due a quattro microsecondi e la trasmissione AOTF per il laser a 488 nanometri e 561 nanometri in modo tale che le immagini mostrino un buon rapporto segnale-rumore senza sbiancamento e senza pixel che indicano la saturazione dell'intensità della fluorescenza. Regolare la potenza laser di 488 e 561 in modo che i livelli di segnale nel canale uno e nel canale tre siano simili.
Impostare il guadagno del moltiplicatore fotografico su 600-800. Immagine da 15 a 20 cellule che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP, cellule che esprimono GFP, ciliegia, GFP e ciliegia e cellule non transettate. Quindi le cellule di immagine co-esprimono le proteine di interesse accoppiate rispettivamente a GFP e ciliegia.
Per calcolare FRET, misurare il segnale del donatore nel canale uno, il canale donatore con eccitazione a 488 nanometri e una banda di emissione da 505 a 530 nanometri. Quindi misurare il segnale accettore nel canale tre, il canale accettore con eccitazione a 561 nanometri ed emissione a oltre 585 nanometri. Infine, misurare il segnale FRET nel canale due, il canale di trasferimento con eccitazione a 488 nanometri ed emissione a oltre 585 nanometri.
Il segnale nel canale due è una somma di quattro diverse componenti: lo spillover spettrale dal segnale del donatore spento nel canale di rilevamento over 585 con un fattore di diafonia S1, il segnale accettore dall'eccitazione diretta da luce a 488 nanometri con un fattore di diafonia S2, l'emissione sensibilizzata dell'accettore da parte di FRET dalla molecola donatrice eccitata, e il segnale di fondo. Le immagini sono state ottenute nel canale donatore, nel canale di trasferimento e nel canale accettore, sono mostrate le cellule che esprimono solo GFP, solo ciliegia, co-espressione GFP e ciliegia e la proteina di fusione della ciliegia GFP. Le efficienze medie di FRET cellulare calcolate nelle cellule NRK che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP e quelle che co-esprimono la ciliegia GFP sono tracciate rispetto al rapporto di intensità del rapporto accettore-donatore o al rapporto molecolare in ciascuna cellula.
Qui sono mostrate immagini FRET normalizzate pixel per pixel di cellule che esprimono la proteina di fusione della ciliegia GFP, che co-esprimono GFP e ciliegia come controllo negativo ed esprimono subunità recettoriali del recettore di Ashwell-Morell. RHL1 e 2 della lectina epatica del ratto sono stati marcati con GFP e ciliegia sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica. Le efficienze medie di FRET cellulare delle cellule che esprimono GFP RHL1 e ciliegia RHL2 e GFP RHL1 delta stock e ciliegia RHL2 sono tracciate rispetto al rapporto molecolare accettore-donatore.
L'approccio FRET quantitativo presentato consente quanto segue. Rilevazione delle interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente. Cambiamenti nelle interazioni proteiche nel tempo.
Differenze nelle interazioni nei compartimenti subcellulari fino al livello pixel per pixel di un'immagine confocale. E la dipendenza del segnale FRET rilevato dal rapporto accettore-donatore molecolare espresso in una cellula viva.
