Questo protocollo può rilevare specificamente nanocristalli contenenti calcio nelle urine umane. Questa tecnica potrebbe potenzialmente essere utile per prevedere le prime fasi della formazione di calcoli renali e altre malattie associate all'urea cristallina. A dimostrare la procedura sarà il Dott. Parveen Kumar, ricercatore IV nel mio laboratorio.
Chiedere ai partecipanti di consumare una dieta a basso contenuto di ossalati per tre giorni e di notte veloce. Quindi raccogliere un campione di urina 24 ore su 24 dai partecipanti prima di farli consumare un carico di ossalato. Nutrire i partecipanti con un frullato contenente frutta e verdura con un carico ossalato di circa otto millimoli.
Chiedere ai partecipanti di raccogliere l'urina per 24 ore dopo il consumo di ossalato e restituirla il giorno successivo. Mantenere tutti i campioni di urina a temperatura ambiente prima della lavorazione. Misurare e registrare il pH delle urine e il volume dei campioni di urina.
Mescolare accuratamente e aggiungere 50 millilitri di urina in un tubo conico sterile etichettato da 50 millilitri. Centrifugare il campione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da banco. Scartare il supernatante, quindi lavare e rimescolare nuovamente il pellet con cinque millilitri di etanolo al 100%.
Centrifugare il campione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da banco. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di etanolo al 100%. Conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per un'elaborazione successiva o procedere immediatamente alla colorazione dei campioni.
Diluire nanoparticelle d'oro di dimensioni di 100 nanometri in acqua ultrapura con un rapporto di 1:1.000 e usarle per ottimizzare le impostazioni sullo strumento. Diluire i campioni di urina 20 volte in acqua prima di macchiare con cinque Fluo-4 AM millimolari per 30 minuti al buio e analizzare i campioni utilizzando NTA. Preparare cristalli di ossalato di calcio e fosfato di calcio come descritto nel manoscritto testuale prima dell'analisi dell'NTA.
Accendere il computer e lo strumento, quindi aprire il software e accendere la fotocamera. Fare clic sull'icona di acquisizione nell'angolo in alto a sinistra della finestra per avviare la modalità di acquisizione. Pulire la piattaforma pompando prima aria utilizzando una siringa millilitro fino a quando la piattaforma non appare pulita.
Aggiungere delicatamente acqua all'apparecchio da due a tre volte e utilizzare un'altra siringa millilitro per rimuovere eventuali bolle d'aria. Una volta che la piattaforma è pulita, aggiungere acqua e verificare la presenza di eventuali contaminazioni sulla superficie visualizzando la fotocamera, quindi aggiungere nanoparticelle d'oro come controllo all'iniettore della pompa di carico del campione per impostare lo strumento. Regolare il livello della fotocamera sullo schermo o sulla manopola sul lato destro dello strumento fino a quando l'immagine inizia a visualizzare pixel colorati, quindi ridurre il livello della fotocamera.
Quindi, regola lo schermo per ottimizzare l'immagine. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine video. Tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e trascinare l'immagine su e giù per ottenere l'intera visualizzazione.
Impostare la velocità di infusione e mettere a fuoco la fotocamera in modo che le nanoparticelle d'oro siano visibili sullo schermo della fotocamera. Impostare la velocità di infusione su alta per la configurazione iniziale per assicurarsi che vengano rilevate le nanoparticelle d'oro. Una volta rilevato, ridurre la velocità a 50 microlitri al minuto per visualizzare le nanoparticelle d'oro.
Regolare il livello della fotocamera per visualizzare le particelle. Per i campioni non macchiati, regola il guadagno dello schermo al livello cinque per ottenere la messa a fuoco della fotocamera e impostare il livello della fotocamera a otto. Una volta impostato lo stato attivo, registrare l'esempio.
Dopo l'ottimizzazione, pulire nuovamente l'apparecchio con acqua prima di valutare altri campioni per assicurarsi che il tubo sia pulito e che le particelle non siano presenti. Per analizzare i campioni macchiati, regolare la fotocamera in base alla posizione del filtro contenente l'apposibile filtro fluorescente e caricare campioni diluiti e macchiati sull'iniettore della pompa di carico del campione, riducendo la velocità a 20 microlitri al minuto per l'analisi. Regola il guadagno dello schermo a cinque e il livello della fotocamera a 13.
Salvare i dati dopo ogni misurazione. Calcola il numero medio di nanoparticelle per tutte e cinque le letture per ogni singolo campione e analizza i dati usando la deviazione standard o l'errore standard della media. Utilizzare test T per l'analisi accoppiata.
Fluo-4 AM era in grado di legarsi sia ai cristalli di ossalato di calcio, che avevano dimensioni compresa tra 50 e 270 nanometri e avevano una concentrazione media di 1.260 milioni di particelle per millilitro, sia ai cristalli di fosfato di calcio, che erano tra i 30 e i 225 nanometri e avevano una concentrazione media di 2.220 milioni di particelle per millilitro. Campioni di urina 24 ore su 24 raccolti prima del carico di ossalato contenevano alcuni nanocristalli urinari di dimensioni compresa tra 110 e 300 nanometri. Al contrario, c'è stato un aumento significativo dei nanocristalli urinari presenti nei campioni post-ossalati.
Per confermare la riproducibilità del metodo, i campioni sono stati misurati tre volte e non vi sono state variazioni significative nelle repliche tecniche. Quando si tenta questo protocollo, potrebbe esserci qualche difficoltà nell'aggiungere campioni senza bolle alla macchina. Per evitare ciò, aggiungere aria e acqua alla macchina, quindi aggiungere lentamente campioni.
Inoltre, assicurati di monitorare continuamente i tuoi campioni e che non ci siano bolle presenti. Questo nuovo metodo sarà testato in individui con malattia del calcolo renale ossalato di calcio per monitorare la progressione della malattia e / o per prevedere il rischio di calcoli renali.
