La scienza morfologica e la qualità delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici nel nocciolo determinano il peso e la qualità dei semi. In questo studio, presentiamo come una semplice popolazione di un intero nocciolo incorporato nella resina LR White e stabiliamo un semplice metodo di aspirazione a secco di interi chicchi. Scegliamo la resina LR White come mezzo incorporato per due motivi principali.
In primo luogo, è bassa viscosità e forte permeabilità, portando alle sue buone applicazioni nella preparazione di queste porsi sezioni di semi, specialmente per i chicchi maturi di cereali con un grande volume e un alto contenuto di amido. In secondo luogo, il campione incorporato nella resina LR White può essere colorato facilmente con molti coloranti chimici per mostrare chiaramente la morfologia dei campioni alla luce con microscopio fluorescente. Le sezioni preparate possono essere specificamente macchiate per mostrare le cellule, i granuli di amido e i corpi proteici chiaramente in comparsa di tutto il nocciolo, e i parametri morfologici possono anche essere analizzati quantitativamente.
Il metodo contiene studi. Qui, usiamo chicchi di mais maturi con volume maggiore e alto contenuto di amido come campione per mostrare i processi passo dopo passo. Per iniziare, aggancia i kernel in una semplice bottiglia.
Aggiungere circa 10 millimetri di glutaraldeide tamponata con fosfato al 2,5%. un altro pH 7.2 e posizionarlo a 4 gradi centigradi per 48 ore per ripararli entrambi. Quindi eserti questi chicchi e tagliarli longitudinalmente o trasversalmente, con uno spessore da due a tre millimetri.
Hai bisogno di una lama affilata a doppia lato. E aggiustarli per altre 48 ore. Quindi, lavare i campioni tre volte con circa 10 millimetri, quindi tampone fosfato da 0,1 M, pH 7,2 per 30 minuti ogni volta.
Per idratare i campioni passo dopo passo, immergerli in circa 10 millimetri di soluzione acquosa al 30% di etanolo per 30 minuti prima e immergerli successivamente in 10 millimetri, quindi 50%70%90% una volta e 100%tre volte. Per infiltrarsi passo dopo passo in un campione, recuperarli successivamente con 10 millimetri di soluzione di resina LR White diluita con etanolo del 25%50%75% una volta e del 100% due volte a quattro gradi centigradi per 12 ore ogni volta. Prima di incorporare, dobbiamo preparare i piedistalli per i campioni.
Aggiungere 250 microlitri di pura resina LR White in un tubo di centrifuga da due millimetri e polimerizzarlo a sei gradi centigradi per 48 ore. Successivamente, aggiungere successivamente 500 microlitri di pura resina LR White e infiltrarsi nel campione nel tubo di centrifuga con un piedistallo. Dopo aver raddrizzare i campioni con ago anatomico, mettere la resina a sei gradi centigradi in forno per 48 ore.
Eseni quei chicchi incorporati dal tubo di centrifuga e ritaglia la resina in eccesso attorno a un campione usando una lama affilata. Posizionare il blocco di resina nel portacampioni di microtono e tagliare la resina superflua sulla superficie del campione e intorno al campione con la lama. Lucidare ulteriormente la superficie del campione infine con un coltello di vetro fino a formare una sezione completa.
Ora è il momento di preparare questa straordinaria sezione con due micron di spessore. Prima dell'affettamento, mettere un piccolo rame parlava di due millimetri sopra il bordo della lama per evitare che una sezione si arricciasse. Man mano che la sezione si allunga, metti un parlato sotto la sezione per sostenerlo.
Successivamente, aggiungere i 100 microlitri di acqua sullo scivolo non sporgente e trasferire con cura la sezione completa e ininterrotta in acqua con i trattati. Scaldarli e asciugarli a 50 gradi centigradi per levigare la sezione rugosa. Infine, due consigli importanti hanno bisogno di attenzione.
In primo luogo, se la sezione si sbriciola o si strappa, prolungare il tempo per ogni infiltrazione di resina del campione. In secondo luogo, se la sezione ha alcune linee parallele al coltello, bloccare saldamente il blocco del campione. Se la sezione ha alcune linee verticali al coltello, si prega di utilizzare un nuovo coltello.
Per osservare la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici, possiamo macchiare le sezioni rispettivamente con illuminante fluorescente 28, soluzione di iodio e R250 blu brillante Coomassie. Per altre macchie specifiche, basarlo sulla ricerca proposta. Qui usiamo la soluzione di iodio per macchiare i granuli di amido come esempio.
Aggiungere 40 microlitri di soluzione di iodio per immergere la sezione. E tienilo nel barattolo per un minuto. E poi coprire il campione con un manicotto di copertura.
E cancellare la soluzione di agente in eccesso intorno ad esso. Osservare e fotografare immediatamente il campione al microscopio illuminato dotato di telecamera CCTV. Possiamo elaborare e analizzare quantitativamente le immagini fotografate per area, accesso lungo o breve e rotondità di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni per kernel utilizzando un software di analisi morfologica.
Stabiliamo un semplice metodo di sessatura a secco per trattenere intere sezioni di dimensioni del nocciolo in resina LR White. Il metodo può preparare sezioni trasversali e longitudinali dell'intero kernel con due micron. o esempi, l'intero seme maturo di colza può essere sessato trasversalmente e longitudinalmente.
Anche le sezioni di un intero nocciolo maturo di mais con un volume maggiore possono essere preparate con successo. Inoltre, il kernel in via di sviluppo, il nocciolo cotto e il kernel germinato possono anche essere studiati usando il metodo. Le sezioni preparate di interi kernel hanno le seguenti applicazioni.
In primo luogo, le sezioni dell'intero nocciolo possono essere utilizzate per osservare la struttura tissutale dei semi. Ad esempio, le sezioni di intero embrione di colza macchiato di safranina possono chiaramente mostrare che è radicale, iper casual, interno ed esterno Le sezioni di tutto il nocciolo possono essere utilizzate per osservare e analizzare la morfologia delle cellule. Ad esempio, le sezioni trasversali dell'intero embrione di colza sono macchiate con illuminante fluorescente 28 e gli oli cellulari sono macchiati specificamente.
La micro-morfologia delle cellule in qualsiasi regione dell'intero embrione può essere visualizzata ad alto ingrandimento. I parametri morfologici delle cellule parenchimali, possono essere analizzati quantitativamente utilizzando software di analisi morfologica e mostrano alcune differenze in diverse regioni dell'embrione. Le sezioni trasversali di tutto il nocciolo di mais macchiate con illuminante fluorescente 28 possono anche esibirsi come morfologia delle cellule, e i parametri morfologici delle cellule sono diversi in diverse regioni di endosperma.
sezioni di intero nocciolo possono essere macchiate con soluzione di iodio per mostrare la sua morfologia dei granuli di amido, ad esempio, le sezioni trasversali e longitudinali dei chicchi di mais macchiati di iodio possono mostrare chiaramente la sua morfologia dei granuli di amido. I granuli di amido in diverse regioni mostrano morfologia, dimensioni e quantità significativamente diverse nelle cellule dell'endosperma. Quindi l'analisi quantitativa dei parametri morfologici dei granuli di amido mostra che sono significativamente diversi in diverse regioni per l'endosperma.
Le sezioni possono essere utilizzate per osservare e analizzare la morfologia dei corpi proteici. Ad esempio, la proteina dell'amido è macchiata di blu usando Coomassie blu brillante R250. La distribuzione spaziale della proteina dell'amido nell'intero embrione di colza può essere osservata in un basso ingrandimento, e la microstruttura può essere mostrata chiaramente ad alto ingrandimento.
Inoltre, i numeri dell'indice di errore e i parametri morfologici dei corpi proteici nelle regioni scelte possono anche essere analizzati quantitativamente. Questa tecnica fornisce la prima e semplice preparazione di sezioni di resina di interi chicchi da semi in via di sviluppo e maturi. Le applicazioni sezionali nella struttura tissutale dell'intero kernel e quindi studiando la morfologia delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici in diverse regioni di un intero kernel.
Le immagini acquisite possono essere analizzate quantitativamente per mostrare i parametri morfologici delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici e confrontarle ulteriormente in diverse regioni dell'intero kernel.
