Questo metodo può essere utilizzato per valutare gli effetti terapeutici di NIR-PIT sui tumori toracici in un modello tumorale clinicamente rilevante. Le procedure NIR-PIT che utilizzano il modello di cancro disseminato pleurico sono facili da capire e da eseguire. Per impostare un modello di diffusione del topo, utilizzare il polistirene espanso per creare un tappo e disinfettarlo con etanolo al 70%.
Attaccare l'ago al tappo con la punta che si estende per cinque millimetri dal tappo. Piegare la punta di un ago calibro 30 con una pinna pulita o contro un oggetto duro pulito con etanolo al 70% e riempire una siringa con una volta 10 alle sei cellule tumorali bersaglio in 100 microlitri di PBS. Confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un anestetizzato, da 19 a 21 grammi, da otto a 12 settimane, femmina, omozigote, topo nudo atimico.
Inserire l'ago nel torace attraverso lo spazio intercostale, spostando l'ago su e giù per evitare di contattare le costole. Quando la punta è passata attraverso lo spazio intercostale, posizionare la siringa in modo che venga premuta contro il mouse e iniettare l'intero volume di cellule bersaglio. Dopo l'iniezione, far rotolare il topo due o tre volte per diffondere le cellule in tutta la cavità toracica e riportare il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino al completo recupero.
24 ore dopo l'iniezione cellulare e ogni giorno successivo, iniettare i topi iniettati con cellule tumorali anestetizzate con 200 microlitri di 15 milligrammi per millilitro di D-luciferina. Dopo 10 minuti, posizionare i mouse in un imager a bioluminescenza e aprire il pannello di controllo dell'acquisizione nel software dell'imager. Selezionare Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione.
Impostare il tempo di esposizione su Auto, il Binning su Small, l'F/Stop su uno per Luminescent e su otto per Photograph e il campo visivo su C.Click Acquire per visualizzare la bioluminescenza. Impostate il formato di visualizzazione su Radianti e selezionate il cerchio dagli Strumenti regione di interesse nel pannello Tavolozza strumenti. Fare clic su Misura regioni di interesse per misurare l'intensità bioluminescente della superficie e utilizzare Configura misurazione per selezionare i valori rilevanti per l'esperimento.
Esportare questa tabella di dati come file csv. Quindi utilizzare i valori di flusso totale per la quantificazione dell'intensità bioluminescente nel file. Prima di eseguire la fototerapia nel vicino infrarosso dei topi iniettati dal tumore, utilizzare un misuratore di potenza per misurare la dose di luce di un laser a lunghezza d'onda di 690 nanometri e regolare l'uscita a 100 milliwatt per centimetro quadrato.
24 ore prima del trattamento, iniettato per via endovenosa 100 microgrammi di anticorpi fotosensibilizzatori coniugati in 50-200 microlitri di PBS attraverso la vena di coda dell'animale iniettato dal tumore. Il giorno del trattamento di fototerapia, posizionare il topo coniugato anestetizzato, carico di tumore in posizione supina e schermare i siti non bersaglio con un foglio di alluminio. Quando tutti gli scudi sono stati posizionati, utilizzare un laser da 100 joule per centimetro quadrato per irradiare la cavità toracica con luce nel vicino infrarosso per circa 30 secondi.
Quando l'irradiazione è completa e il topo si è svegliato, riportare l'animale nella sua gabbia e misurare la bioluminescenza ogni giorno come dimostrato. In questa analisi rappresentativa, la coniugazione dell'anticorpo anti-podoplanina con IR700 è stata confermata dall'analisi SDS-PAGE. Dopo l'iniezione di cellule tumorali, l'imaging a bioluminescenza e la tomografia per immagini a luminescenza diffusa devono essere eseguite per determinare quali topi esprimono sufficiente attività di luciferasi nella cavità toracica per ulteriori studi.
Al quinto giorno dopo l'iniezione, i topi iniettati con anticorpo anti-podoplanina IR700 dimostrano un'elevata fluorescenza IR700 e attività luciferasi nei tumori toracici, indicando che l'anticorpo coniugato IR700 iniettato per via endovenosa raggiunge i siti tumorali pleurici disseminati. In particolare, i topi pleurici disseminati trattati con fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso mostrano una ridotta attività della luciferasi, mentre le unità di luce relative nel gruppo di controllo mostrano un graduale aumento di intensità. Poiché l'energia di irradiazione NIR richiesta dipende dalla linea cellulare e dagli anticorpi, assicurarsi di controllare le condizioni in anticipo in vitro.
