Campionamento ed estrazione in loco di tumori cerebrali per l'analisi metabolomica e lipidomica

Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire un'estrazione da tumori cerebrali all'in o accanto a un server utilizzando fibre di microestrazione in fase solida. Questa tecnica consente l'estrazione di piccole molecole direttamente dai tumori reinsediati e offre l'opportunità di una rapida diagnostica intraoperatoria accoppiando i dispositivi di estrazione direttamente alla strumentazione analitica. Per preparare il dispositivo di microesezione in fase solida, tagliare la codifica di ogni sonda del dispositivo di microesezione in fase solida con rivestimenti in modalità mista o C18 a una lunghezza appropriata in base alle dimensioni del tumore.

E immergere le sonde e una soluzione di acqua da 50 50 metanolo per almeno un'ora prima della raccolta del campione. Questo protocollo si concentra sui tumori cerebrali, ma la strategia può essere implementata per la diagnosi di molti tumori diversi. La tecnologia è completamente portatile, quindi non è necessario alcun dispositivo aggiuntivo.

Il prima possibile dopo la rimozione del tumore immergere le fibre della sonda con acqua di grado LCMS per cinque secondi prima di inserire le fibre il più possibile nel campione di tessuto tumorale cerebrale, per garantire che l'intera fase di estrazione si trovi all'interno del tumore. Lasciare le sonde all'interno del tessuto per 30 minuti con precisione per eliminare le fonti di errore dovute alla presenza di artefatti da fonti diverse dal tumore del campione, posizionare le fibre della sonda condizionate sul tavolo per lo stesso periodo di tempo. Durante l'estrazione, etichettare le fiale HPLC da utilizzare per lo stoccaggio della sonda dopo l'estrazione.

Al termine dell'estrazione, immergere le fibre in acqua di grado LCMS per tre secondi per rimuovere eventuali detriti di sangue o cellulari e inserire ogni sonda attraverso il fondo del setto di un singolo cappuccio del flaconcino HPLC per immobilizzare le fibre. Quindi limitare le fiale con le fibre immobilizzate e posizionare le fiale in un contenitore di trasporto appropriato. All'arrivo in laboratorio, posizionare immediatamente le fiale in un congelatore meno 30 o meno 80 gradi Celsius rispettivamente per non più di tre o cinque anni.

Una volta raccolti tutti i campioni di un singolo esperimento, posizionare le fiale contenenti le fibre in modalità mista a temperatura ambiente. ed etichettare due flaconcini millilitro per il desorbimento posizionare un inserto di vetro in ogni flaconcino e aggiungere 300 microlitri di 80 20 soluzione di acqua acetonitrile appena preparata ad ogni inserto. Completamente immerso la codifica di ogni sonda in singole fiale del solvente di desorbimento e agitare le fiale per 120 minuti a 1.200 giri al minuto su un vortice.

Una volta completato il desorbimento, rimuovere i tappi dalle fiale e mettere da parte 10 aliquote microliter da ogni file contenente estratto dal tumore per preparare un campione di controllo qualità. Quindi chiudere le fiale con nuovi tappi e posizionare le fiale nel campionatore automatico di quattro gradi Celsius di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione cromatografico liquido. Per preparare i campioni per l'analisi lipidomica posizionare le fiale contenenti le fibre C 18 a temperatura ambiente ed etichettare due flaconcini HPLC millilitro per l'interruzione posizionare inserti in vetro silanizzato nelle fiale e aggiungere 200 microlitri di soluzione di metanolo isopropanolo appena preparata ad ogni inserto.

Immergere completamente ogni rivestimento della sonda nel solvente e agitare i campioni per 50 minuti a 1.200 giri al minuto su un vortice. Alla fine del tempo, interrompere il desorbimento rimuovendo i tappi e quindi mettere da parte un'aliquota di 10 microliter da ogni file contenente estratto dal tumore per preparare il campione di controllo qualità e chiudere le fiale con nuovi tappi. Quindi, posizionare le fiale nel campionatore automatico di quattro gradi Celsius dello spettrometro di massa ad alta risoluzione della cromatografia liquida.

La riproducibilità dell'analisi strumentale è stata determinata come molto buona sulla base dello stretto raggruppamento dei campioni di controllo qualità sul grafico di analisi dei componenti principali. Questi dati lipidomici per campioni raccolti da pazienti con gliomi e meningiomi evidenziano la capacità dei campioni tumorali di distinguersi in base alla loro origine istologica e malignità. Come illustrato con questi dati metabolomici, i gliomi possono essere ulteriormente divisi in base al loro grado di malignità e o in base alla presenza o assenza di mutazioni di interesse.

L'analisi statistica consente anche la selezione di composti specifici all'interno dei gruppi studiati. È essenziale controllare attentamente i tempi di estrazione e mantenere condizioni riproducibili per tutti i campioni. In alternativa, i campioni possono essere sciolti dalla fibra direttamente a Ms senza separazione cromatografica consentendo l'analisi mirata di marcatori specifici e accorciando l'intera procedura a diversi minuti.